一种大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种大肠杆菌感受态细胞的制备及其 转化方法。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA(PlasmidDNA，PhageDNA等），处于这种 状态的细胞称为"感受态细胞"（CompetentCell)。将外源DNA分子导入受体细胞，使之获 得新的遗传性状的过程称为"转化"。在微生物学、分子生物学、基因工程等研究领域，经常 要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。
[0003] 感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其质量的好坏直接影响 到后续实验工作的进行。常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法、Hanahan和Inoue法。 CaCl2法（CohenSN,ChangACY,HsuL.Nonchromosomalantibioticresistancein bacteria:genetictransformationofEscherichiacollbyR-factorDNA.Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 1972，69: 2110-2114.)是目前实验室制备感受态细胞的常规方 法，该方法简便易行，但制备的感受态细胞转化效率较低，只能满足常规分子生物学实验需 求；Hanahan法（HanahanD.StudiesontransformationofEscherichiacollwith plasmid.J.Mol.Biol. 1983，166: 557-580.)对操作人员的技巧、细心程度和试剂纯度 要求较高，可重复性低；Inoue法（InoueH·，HNojimaandOkayamaH.Highefficiency transformationofEscherichiacoliwithplasmids.Gene. 1990, 96: 23-28.)虽然 感受态细胞的转化效率较高，但对细菌的〇D_值要求比较严格，并且培养温度是18°C，细 菌在此温度下生长缓慢，培养时间较长(约20~50h)，过程相对繁琐。
[0004] 目前，感受态细胞的制备和转化过程十分繁琐，制备过程需要多次离心收集细胞、 重悬细胞；转化过程中，热激反应前需要长时间冰浴，热激反应后需要加入培养基进行长时 间培养复苏，大大降低了实验效率。此外，利用常规方法制备的感受态细胞，转化效率较低， 不能满足特殊的生物学实验的要求(如DNA文库构建、大片段DNA的转化)。因此，研究一种 转化效率高、操作简单快速、可重复性高的方法用于感受态细胞的制备和DNA转化，对分子 生物学的研究具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，简化大肠杆菌感受态细胞的制备和转化步骤，提高大肠杆菌 的DNA转化效率，提供一种大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明的技术方案如下： 一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括以下步骤： a)挑取新活化的大肠杆菌单菌落至2mlLB液体培养基中，30°C，200rpm振荡培养过 夜； b)取50〇μ1过夜培养物转接到50mlS0B液体培养基中，30 °C，200rpm振荡培养至0D6。。 值为0. 4~0. 6 ; c)将菌液转移到预冷的无菌离心管中，加入5ml预冷的缓冲液I，混匀，冰浴lOmin; d) 于4°C以4000rpm离心5min收集细菌； e) 用2ml预冷的缓冲液II重悬细菌，冰浴lOmin后，10〇μ1/管分装，-80°C保存，即得 到大肠杆菌感受态细胞。
[0007] -种大肠杆菌感受态细胞的转化方法，包括以下步骤： 1) 取一管上述大肠杆菌感受态细胞，冰上融化后加入相应量的质粒DNA，混匀； 2)于42°C热击90~120sec; 3)将菌液涂布于抗性平板上，37°C培养12~16h后菌落计数，计算转化效率。
[0008] 上述大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述缓冲液I为包含以下成 分的水溶液：〇. 5~1. 5M氯化钙，0. 1~0. 5M氯化锰，0. 1~0. 5M甘氨酸，0. 1~0. 5% (v/v)去垢 剂，pH值为4. 0~6. 0 ;其中所述去垢剂由以下试剂中的一种或几种组成：聚乙二醇辛基苯 基醚（Tritonχ-100)、聚氧乙稀失水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20)或乙基苯基聚乙二醇 (NP-40)。
[0009] 所述缓冲液II为包含以下成分的水溶液：50~150mM氯化钙，10~50mM氯化锰， 10~50mM甘氨酸，0· 5~2mM三磷酸腺苷（ATP)，0. 5~2mM二硫苏糖醇（DTT)，20~10(^g/ml核酸 沉淀剂，5~15% (v/v)二甲基亚砜（DMS0)，pH值为4. 5~6. 5 ;其中所述核酸沉淀剂由以下试 剂中的一种或几种组成：糖原（Glycogen)、酵母tRNA或鲑鱼精DNA。
[0010] 本发明的有益效果是：利用特殊配方的缓冲液制备大肠杆菌感受态细胞，简化了 感受态细胞的制备和转化步骤。与现有方法相比，本发明方法的感受态细胞制备过程只需 离心一次；转化过程操作简单、快速，可以省略DNA转化过程的冰浴步骤和转化后大肠杆菌 细胞的复苏步骤，并且具有较高的转化效率。本发明一般可获得大于lXl〇scfu/^gDNA转 化效率，较佳为大于5X10scfu/^gDNA转化效率，最佳为大于1X109cfu/^gDNA转化效率， 本发明方法的转化效率比现有方法高5~50倍，不仅能满足常规的分子生物学实验要求，也 能够满足构建基因文库等复杂实验对转化效率的要求，是一项较为实用的新技术，具有广 阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0011] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0012] 实施例1:大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备及转化效率测定 大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备步骤如下：挑取新活化的大肠杆菌单菌落至2mlLB液体培养基中，30°C，200rpm振荡培养过夜；取50〇μ1过夜培养物转接到50mlSOB液体培养 基中，30°C，200rpm振荡培养至0D6。。值为0. 4~0. 6 ;将菌液转移到预冷的无菌离心管中，加 入5ml预冷的缓冲液I，混勾，冰浴lOmin;于4°C以4000rpm离心5min收集细菌；用2ml预 冷的缓冲液Π重悬细菌，冰浴lOmin后，10〇μ1/管分装，-80°C保存，即得到大肠杆菌DH10B 感受态细胞。
[0013] 上述大肠杆菌DH10B感受态细胞，转化步骤如下：取一管上述大肠杆菌DH10B感受 态细胞，冰上融化后加入?μL浓度为lOpg/μΙ的PUC19DNA，混匀；于42°C热击9〇sec ;将菌 液涂布于抗性平板上，37°C培养12~16h后菌落计数，重复转化实验三次，计算平均转化效 率。
[0014] 本实施例中，缓冲液I为包含以下成分的水溶液：1M氯化钙，0. 2M氯化锰，0. 2M甘 氨酸，0.1% (v/v)Tritonχ-100,调节pH值为 4.5〇
[0015] 缓冲液II为包含以下成分的水溶液：90mM氯化妈，10mM氯化猛，20mM甘氨酸，ImM ATP，ImMDTT，5〇Pg/mlGlycogen，7% (v/v)DMS0,调节pH值为 5. 3。
[0016] 对比例1 :CaCV法制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及转化效率测定 CaCV法制备大肠杆菌DH10B感受态细胞，步骤如下：挑取新活化的大肠杆菌单菌落至 2mlLB