分化培养基及其在制备神经干细胞中的用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物领域，具体的，本发明涉及培养基及其应用，更具体得，本发明涉及一种分化培养基、分化培养基在制备神经干细胞中的用途以及一种制备神经干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somatic stem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等，在成体组织中存在的。
[0003]1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。而人的胚胎干细胞则始于1998年，美国威斯康辛大学(Universityof Wisconsin)科学家汤姆森(James A.Thomson)带领研究团队首次从人类胚胎组织中提取培养出胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell, ES Cell)株，并且证实此株细胞具有全會泛干细胞特征[Thomson, J.A.，et al.Embryonic stem cell lines derived from humanblastocysts.Science, 282 (1998): 1145-1147.]。这篇论文标志着一个时代的到来，而汤姆森也被人称作“干细胞研究之父”。
[0004]人胚胎干细胞(hES)细胞研究的应用前景主要是再生医学领域，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。
[0005]然而，一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面:
(1)供体卵母细胞的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证；(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应；(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题；(4)体外保持hES风险。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。
[0006]为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物0ct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达0ct4[Byrne JA, et al.Nuclei of adult mammalian somatic cells are directlyreprogrammed to oct_4stem cell gene express1n by amphibian oocytes.Curr B1l2003 ；13:1206-1213.]ο
[0007]2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了 Fbxl5+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)。
[0008]Yamanaka研究小组利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人皮肤成纤维细胞中，也成功获得了 iPS细胞。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型[Takahashi K et al，Induct1n of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 2007 ； 131:861-872.] 0 与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28 等 4 个基因进行转导[Yu J et al，Induced pluripotent stem cell linesderived from human somatic cells.Science 2007，318:1917—1920]。这一被学界称为生物科学“里程碑”的重大突破有望帮助科学家绕过克隆技术的伦理、道德纷争，为医学应用打开大门。
[0009]继此之后，iPS在重编程的诱导方法、诱导效率、诱导细胞来源及生物安全性方面均陆续取得了重要突破。在iPS细胞再分化方面，也得到了一定的发展。目前，在iPS细胞的上皮细胞分化、肝细胞分化等方面，均已建立了较为稳定的分化体系[Ahmad Sm, et al.Differentiat1n of human embryonic stem cells into cornealepithelial-like celIs by in vitro replicat1n of the corneal epithelialstem cell niche.Stem Cells,2007, 25(5):1145-55.；Metallo CM, et al.Directeddifferentiat1n of human embryonic stem cells to epidermal progenitors.Methods Mol B1l, 2010，585:83-92.；Song ZH,et al.Efficient generat1n ofhepatocyte—1ike cells from human induced pluripotent stem cells.CellRes, 2009, 19 (11)，1233-1242.]。在神经干细胞细胞分化方面，iPS细胞与ES细胞也取得了一定的石开究成果[Kim DS, et al.Robust enhancement of neural differentiat1n fromhuman ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiat1npropensity.Stem Cell Rev, 2010, 6(2):270-281.]0
[0010]神经干细胞是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。神经干细胞具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新，从而为神经组织提供大量的功能性细胞，在多种神经系统疾病方面具有着重要的应用价值和研究意义。但是，神经干细胞的来源十分有限:从神经组织中进行原代分离，在很大程度上受到组织来源的限制；由其他种类成体干细胞分化而来的神经前体细胞，在功能上又存在着一定的限制性，这主要是由于成体干细胞本身分化能力有限，难以完全再生功能性神经干细胞。所以，开发神经干细胞的来源一直是神经科学亟待解决的问题。
[0011]ES和iPS技术的建立，为神经干细胞的再生开发了新的研究方向，这两种细胞自我更新能力较强，且具有高度的分化能力，目前，已有多个课题组建立了 ES和iPS细胞向神经干细胞分化的技术方法，例如:EB诱导法，PA6细胞共培养法等[Bain G, et al.Embryonicstem cells express neuronal properties in vitr0.Dev B1l.1995,168(2):342-357.；Okabe S, et al.Kang HC, et al.Behav1ral improvement after transplantat1n ofneural precursors derived from embryonic stem cells into the globally ischemicbrain of adol