与水稻叶绿体rna聚合酶pep及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种与水稻叶绿体RNA聚合酶 PEP(plastid-encodedplastidRNApolymerase)及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因 和应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在世界各地广泛种植。水稻也是我国最主 要的粮食作物之一，全国约有一半以上的人口以水稻作为主粮。我国是世界水稻总产量最 高的国家，在2012年水稻总产量约占全世界的29% (约2亿吨），同时也占当年我国主要 谷类作物总产量的38%。世界人口的迅速增长，耕地面积的锐减和生态环境的急剧恶化加 剧了粮食供应不足和人口过度增长之间的矛盾，使进一步增加单位面积的粮食产量成为全 世界育种家们亟需解决的难题之一。惟一在叶绿体内进行的光合作用是与粮食产量直接相 关的生命活动。光合作用在将C02转化为碳水化合物的过程中也将太阳能转化为生物能， 为包括人类和动物在内的非自养生物提供了必需的物质基础和能量来源。鉴于叶绿体在提 高作物产量和环境保护方面的重要作用，叶绿体的起源，分化，发育和功能的研究受到越来 越多的关注和重视。叶绿体的正确分化和发育需要PEP依赖基因的正确表达。
[0003]PEP是成熟叶绿体中最主要的RNA聚合酶，主要负责与光合作用相关基因的转录。 PEP是一个巨大的动态复合体，由叶绿体基因编码的核心亚基与细胞核基因编码的外围亚 基组成。外围亚基对于PEP行使正常的转录功能是必需的，然而对于PEP外围亚基的种类 和功能还不是特别清楚。已报道的PEP外围亚基的功能涉及氧化还原态的维持，活性氧的 清除和核蛋白的降解等。近年来对于PEP外围亚基的研究主要集中在拟南芥等双子叶植物 中，在单子叶植物玉米中也有少量报道，然而在重要作物水稻中尚无此类突变体和基因被 报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的蛋白 及其编码基因和应用。
[0005] 本发明提供的蛋白质，命名为WSL3蛋白，来自水稻栽培品种93-11，是如下（a)或 (b)：
[0006] (a)由SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] (b)将SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的由SEQIDNO. 1衍生 的蛋白质；
[0008] 上述（b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQIDN0. 2所示的DNA序列中缺失/ 添加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在 其5'端和/或3'端连上标签的编码序列得到。
[0009] 编码所述WSL3蛋白的基因（WSL3基因）也属于本发明的保护范围。
[0010] 所述WSL3基因是如下（1)或⑵或（3)或⑷的DNA分子：
[0011] (1)编码区如SEQIDm2所示的DNA分子；
[0012] (2)基因组如SEQIDN0. 3所示的DNA分子；
[0013] (3)在严格条件下与⑴或（2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
[0014] (4)与（1)或⑵限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98 %或至少具有99 %同源性且编码与植物叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关蛋白的 DNA序列。
[0015] 所述严格条件可为在0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液中，在65°C下杂 交并洗膜。
[0016] 含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
[0017] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
[0018] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆 贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0019] 使用所述基因构建重组植物表达载体时，可使用所述基因本身启动子（序列4)， 也可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病 毒（CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启 动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译 增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始 密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始 区域或结构基因。
[0020] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境（如低温）筛选转化植株。
[0021] 所述重组表达载体可为在？〇]1^1390(参见图1)的多克隆位点把11(1111和 BamHI之间插入所述基因WSL3的自身启动子和cDNA序列，所述重组质粒具体可为 pWSL3Pro: :WSL3cDNA;所述pWSL3Pro: :WSL3cDNA是通过重组技术将pCUbil390 载体的泛素 启动子替换为所述基因WSL3的自身启动子后再将所述基因WSL3的cDNA序列插入到替换 启动子的pCUbi1390载体的多克隆位点BamHI处得到。
[0022] 含有以上任一所述基因（WSL3)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明 的保护范围。
[0023] 扩增所述基因（WSL3)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明的另一个目的是提供一种培育叶绿体发育正常的转基因植物的方法。
[0025] 本发明提供的培育叶绿体发育正常的转基因植株的方法，是将所属基因导入叶绿 体发育异常的植物中，得到叶绿体发育正常的转基因植物；所述叶绿体发育异常植物为细 胞中叶绿体不发育或发育迟滞，叶绿体不含或只包含很少的类囊体导致植物整体或叶片褪 绿的植物；所述叶绿体发育正常的转基因植物为细胞中叶绿体发育正常，具有丰富的类囊 体，植物整体或叶片为绿色的植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入叶绿体 发育异常的植物中。所述叶绿体发育异常植物可为wsl3。
[0026] 所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述 方法均可应用于水稻育种。
[0027] 利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导 入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti 质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方 法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单 子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨 树、草坪草、苜宿等。
[0028] 有益效果：
[0029] 本发明首次发现并克隆到一个定位于水稻叶绿体且与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP 及叶绿体发育相关的基因WSL3，WSL3基因编码蛋白为水稻PEP酶的一个外围亚基。本发明 的实验证明，缺失WSL3基因的植株叶片褪绿，尤其是在低温（如25°C)时植株整株完全白 化、叶片色素含量显著降低、叶肉细胞中不含叶绿体或仅含很少的未发育或发育不完全的 叶绿体。即WSL3蛋白是叶绿体正确发育所需要的。将所述蛋白的编码基因导入叶绿体发 育异常的植物中，可以培育成叶绿体发育和色素含量正常的植物。所述蛋白及其编码基因 可以应用于植物遗传改良。
【附图说明】
[0030]图 1pCUbil390 载体图谱
[0031] 图2野生型和突变体wsl3的表型
[0032]A野生型和突变体wsl3在低温（恒温25°C)时的表型；B野生型和突变体wsl3在 较高温度（恒温30°C)时的表型。
[0033] 图3野生型和突变体wsl3的叶绿素含量测定
[0034]A野生型和突变体wsl3在低温（恒温25°C)条件下生长至三叶期时各叶片的色 素含量；B野生型和突变体wsl3在较高温度（恒温30°C)条件下生长至三叶期时各叶片的 色素含量。WT:野生型；L2:第二真叶；L3:第三真叶；Chia:叶绿素A;Chlb:叶绿素B。
[0035] 图4野生型和突变体wsl3叶肉细胞中叶绿体的超微结构观察
[0036] 图5WSL3基因的精细定位
[0037] 图6WSL3基因示意图，显示wsl3中突变形式
[0038]图7互补转基因株系的PCR鉴定
[0039] 图8野生型、互补转基因株系和突变体在恒温