一种普通生酮基古龙酸菌的诱变筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，尤其属于诱变育种技术领域。具体地，本发明涉 及到维生素C生产菌株普通生酮基古龙酸菌的诱变筛选方法。本发明还提供了一种普通生 酮基古龙酸菌筛选用的特制培养基，可以实现普通生酮基古龙酸菌单菌落平行培养。
【背景技术】
[0002] 维生素C是人体必须的一种水溶性维生素，具有抗氧化性、提高机体免疫力等作 用，广泛应用于药品、食品、化妆品等领域。
[0003]目前维生素C主要采用二步发酵法生产工艺，普通生酮基古龙酸菌 (Ketogulonigeniumvulgare)搭配巨大芽孢杆菌等将底物L-山梨糖转化为古龙酸（S卩2-酮 基-L-古龙酸），在此过程中，巨大芽孢杆菌等只是伴生菌，辅助普通生酮基古龙酸菌生长和 产酸，后者起到更关键的作用。因此工业生产中，需要不断筛选更高效的普通生酮基古龙酸 菌来提高生产效率。
[0004] 菌种选育方法中化学诱变采用的诱变剂毒性较大，环境污染高，操作危险性高。物 理诱变剂X射线、快中子、离子束注入等设备复杂，专业性要求高。近年来，等离子体诱变诱 变育种设备的开发，提供了另外一种操作简单有效的选择，但各个菌种特性不同，仍需要对 应不同菌种探索调节诱变条件。
[0005]普通生酮基古龙酸菌单菌生长能力弱，特别是经过诱变处理的菌株，普通的培养 条件很难实现单菌落生长。中国专利申请（申请号:201210308418 .X，公开日2013年1月2日） 虽然提供了平板上单菌落生长方法，但仍然需要搭接伴生菌来实现，而搭接方式是在平板 上间隔点接，培养过程中仍不能实现普通生酮基古龙酸菌各个单菌落的平行生长，而且伴 生菌菌落大，会覆盖诱变菌株，使诱变菌株遗漏，不能全部扩大培养，在扩大培养过程中，仍 采用搭接伴生菌的方法，此过程操作人员人为因素影响较大，造成伴生菌过大影响了各个 单菌落的增殖培养，进而影响了筛选结果的稳定性。
[0006]为了更高效生产维生素C，从菌种角度而言，需要提高普通生酮基古龙酸菌和伴生 菌的生产效率，尤其要提高普通生酮基古龙酸的生产效率。将等离子体诱变用于普通生酮 基古龙酸菌诱变育种，需要解决采用怎样的诱变条件，需要解决如何培养诱变普通生酮基 古龙酸菌单菌菌落以及如何以更简易稳定的操作方式筛选出性能优良变异菌落的技术问 题。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种普通生酮基古龙酸菌的单 菌诱变筛选方法，将普通生酮基古龙酸菌进行诱变处理后的菌株培养形成单菌落，接着单 菌落扩大培养，然后加入伴生菌，接至发酵培养基中培养，最终筛选出目的菌株。
[0008]该方法以维生素C发酵生产中的普通生酮基古龙酸菌为出发菌株，采用低温常压 等离子体诱变设备诱变处理后，涂布至固体培养基均匀生长出单菌落，继续单菌增殖扩大 培养，搭配伴生菌摇瓶筛选目的菌株。通过以上技术，提高了普通生酮基古龙酸菌诱变筛选 的平行性，增加获得高效菌株的几率。
[0009]第一个方面，本发明将等离子体诱变诱变育种应用于普通生酮基古龙酸菌诱变育 种。
[0010]适合于普通生酮基古龙酸菌诱变育种的等离子体处理参数为:处理温度20°C~35 °C，氦气流量为5L/min~15L/min，射频电源输入功率100W，处理时间20s~120s。
[0011] 本发明将等离子体诱变应用于普通生酮基古龙酸菌诱变育种，采用的是常压等离 子体。采用氦气为工作气体，则等离子源中含有多种化学活性离子成分，能够产生更丰富的 变异。
[0012] 处理温度20°C~35°C。优选采用较低温度，例如20°C。
[0013] 氦气流量为5L/min~15L/min。优选采用10L/min。
[0014] 处理时间20s~120s。优选采用100s。
[0015]这种诱变育种具有成本低、操作方便等优点，造成的变异多样性更大，而且对环境 没有污染，不危害操作人员的人身安全。
[0016]这种诱变育种方式获得的是非转基因变异菌株。
[0017]第二个方面，本发明提供了一种诱变普通生酮基古龙酸菌的诱变方法，包括：1.将 出发菌株普通生酮基古龙酸菌制成l〇5cfu/ml~106cfu/ml的菌悬液;2.取10μ1~20μ1至载 片上接受等离子体处理，处理温度20°C~35°C，氦气流量为5L/min~15L/min，射频电源输 入功率100W，处理时间20s~120s;3.诱变后载片置于lml生理盐水中，震荡形成菌悬液。
[0018] 第三个方面，本发明提供了一种筛选普通生酮基古龙酸菌的筛选培养基，该筛选 培养基包含伴生菌菌体。
[0019]本发明提供的普通生酮基古龙酸菌筛选培养基为固体培养基，在培养基中含有伴 生菌菌体。
[0020] 优选地，普通生酮基古龙酸菌固体筛选培养基为平板培养基，在培养基中含有伴 生菌菌体。
[0021] 伴生菌菌体是通过培养伴生菌、将菌液浓缩干燥制得的伴生菌菌体干粉。将伴生 菌菌体干粉作为筛选培养基一个成分使用，是本发明的一个创新之处。
[0022] 由于普通生酮基古龙酸菌难以生长，需要搭配伴生菌才能生长。在中国专利申请 201210308418.X提供的平板上单菌落生长方法中，需要搭接伴生菌，搭接方式是在平板上 间隔点接。
[0023]本发明的固体筛选培养基将伴生菌菌体作为一种培养基成分添加进培养基中，可 以使固体筛选培养基表面提供一个均等的生长环境，使普通生酮基古龙酸单菌落在相同的 微环境中平行生长，是一种高效筛选培养基。
[0024]在一个实施方式中，本发明提供的培养基的组成配方(mg/ml)为:L-山梨糖2~100 mg/ml，酵母浸粉1~30mg/ml，硫酸镁0.1~10mg/ml，活性干酵母10~200mg/ml，伴生菌 菌体0·1~200mg/ml，蛋白胨5~50mg/ml，琼脂10~30mg/ml。即每一成分在筛选培养基 中的浓度单位为mg/ml。
[0025]这里的"伴生菌菌体0.1~200mg/ml"表示伴生菌菌体称重的计量单位，为折干计 算，单位为mg，配入培养基单位为mg/ml。
[0026]这种培养基可以制成平板培养基、斜面培养基等。
[0027]由于将伴生菌菌体分散到培养基中，当诱变后的普通生酮基古龙酸菌菌液被稀释 到适当浓度涂板培养时，就会使普通生酮基古龙酸菌单菌落平行生长。
[0028]本发明的筛选培养基克服了中国专利申请201210308418.X中的伴生菌对普通生 酮基古龙酸菌单菌落生长的不均等影响。
[0029]在本发明的筛选培养基中，可以使用的伴生菌菌体为巨大芽孢杆菌或蜡状芽孢杆 菌，也可以是其他适合于和普通生酮基古龙酸菌共同发酵生产古龙酸的菌种。本发明对伴 生菌的种类不加限制，本领域技术人员知道这些伴生菌，并能够将其用在本发明的培养基 中。
[0030]第四个方面，本发明提供了一种筛选普通生酮基古龙酸菌诱变菌株的筛选方法， 包括：1.制备固体筛选培养基，培养基配方(mg/ml): L-山梨糖2~100，酵母浸粉1~30，硫 酸镁0.1~10,活性干酵母10~200,伴生菌菌体0.1~200,蛋白胨5~50,琼脂10~30;2.将 诱变的菌悬液涂布至固体培养基上；3.培养温度25°C~35°C，培养48h~120h，形成诱变菌 株单菌落，从中筛选符合要求的变异株。
[0031]第五个方面，本发明提供了 一种普通生酮基古龙酸单菌扩大培养方法，包括：1.制 备扩大培养基，培养基配方(mg/ml) :L-山梨糖2~100,酵母浸粉1~30,硫酸镁0.1~10,活 性干酵母10~200，蛋白胨5~50，琼脂0~30; 2.将固体培养基上的单菌落，接入增殖培养基 扩大培养，培养温度25°C~35°C，培养48h~120h。
[0032]第六个方面，本发明提供了一种古龙酸发酵制备方法，包括：1.将扩大培养完成的 普通生酮基古龙酸单菌，按3~20:1的数量比例加入伴生菌，形成混合菌;2.接种混合菌至 发酵培养基中，培养后检测发酵液中古龙酸的含量及残余山梨糖的浓度。
[0033]普通生酮基古龙酸菌单菌与伴生菌数量比例3~20:1采用单菌计数。
[0034]可以采用通用的细菌计数方法获得菌液中单菌浓度，通过浓度计算，获得上述比 例的混合菌液。
[0035]第七个方面，本发明提供了一种古龙酸发酵用的混合菌种的筛选方法，包括：1.将 扩大培养完成的普通生酮基古龙酸单菌，按3~20:1的数量比例加入伴生菌，形成混合菌； 2.接种混合菌至发酵培养基中，培养后检测发酵液中古龙酸的含量及残余山梨糖的浓度。
[0036]普通生酮基古龙酸菌单菌与伴生菌数量比例3~20:1采用单菌计数。
[0037]可以采用通用的细菌计数方法获得菌液中单菌浓度，通过浓度计算，获得上述比 例的混合菌液。
[0038]通过上述这些方面的诸多成果，本发明提供了一种普通生酮基古龙酸菌的单菌诱 变筛选方法。
[0039]本发明的目的是这样实现的，其特征在于： 工艺技术步骤如下： 1普通生酮基古龙酸菌株诱变过程： 将出发菌株普通生酮基古龙酸菌制成l〇5cfu/ml~106cfu/ml的菌悬液，取?ομL~20μ1 至载片上，处