用于检测细菌mcr-1基因的引物对、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗生素耐药基因检测技术领域，具体涉及用于检测细菌MCR-1耐药基 因的引物对、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 自20世纪20年代开始，大量天然抗生物包括青霉素、链霉素等相继被发现，由此人 类打开了抗生素时代，在与细菌的对抗中占有绝对优势。但随着对抗生素使用的过度依赖， 细菌抗药问题日益凸显。抗生素的滥用对随机变异的耐药性细菌被筛选并富集等，使得一 代代抗生素药物威力减弱、甚至失效。人类与细菌的战争围绕"抗药性"问题逐渐转入"持久 战"的局面。多粘菌素(Polymyxins)是多粘杆菌培养液中提得的一组多肽类抗生素，有5种 成分(A，B，C，D，E).临床常用的是多粘菌素B(P0lymyXinB)和多粘菌素E(C0liSlin，抗敌 素）。多粘菌素是一种包含药用粘菌素并在畜牧业中广泛使用的抗生素。多粘菌素被认为是 人类抗击细菌的最后防线。
[0003]目前，研究人员发现一些动物和生肉中采集的大肠杆菌样本内存在一种新型的抗 生素耐药基因MCR-1基因；另外，在住院患者的大肠杆菌和肺炎克氏杆菌样本中也发现了 MCR-1基因。MCR-1基因以质粒为载体存在于细菌中，能够以水平基因转移方式在不同菌株 间进行遗传物质的交换。这种转移模式打破亲缘关系的界限，能够在不同细菌之间传播，且 速度快。这一特性与几年前在印度发现的抗药性基因NDM-1情况类似，而携带有NDM-1的细 菌几乎能够抵抗所有的抗生素，包括"杀手锎"碳青霉烯类。MCR-1基因的发现，预示着抗生 素最后一道防线一一多粘菌素已然遭到威胁。
[0004]因此，对于MCR-1基因的检测对于监控耐药细菌爆发，指导患者感染用药具有重要 作用。
[0005]但目前尚未存在适用于MCR-1基因检测的引物、探针以及试剂盒。
【发明内容】
[0006]鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种用于检测细菌MCR-1基因的引物对、 探针、试剂盒以及其使用方法，可以检测MCR-1耐药基因，并且实现耐药基因定量测定，具有 特异性强、灵敏度高等优点。
[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008]本发明提供一种用于检测细菌MCR-1基因的引物对，包括下述引物对：
[0009]检测MCR-1基因的上游引物，包括SEQIDN0.1所示的序列，SEQIDN0.1所示的序 列为5 '-TTGCTCTACTGGCATTTATTTGG-3'；
[0010] 检测MCR-1基因的下游引物，包括SEQIDN0.2所示的序列，SEQIDN0.2所示的序 列为5 ' -ACCATGGTTCAGCATCAGACAA-3 '。
[0011] 优选地，检测MCR-1基因的上游引物为SEQIDN0.1所示的序列，检测检测MCR-1基 因的下游引物为SEQIDN0.2所示的序列。
[0012] 用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至200bp的范围中，这可以使得能够 在短时间内特异性基因。本发明通过上述引物的选取，可以快速、方便、高灵敏度、特异性强 的检测MCR-1基因。并对于MCR-1基因定性、定量检测。
[0013]本发明还提供一种用于检测细菌MCR-1基因的探针，包括与上述的检测MCR-1基因 引物对匹配的MCR-1探针，MCR-1探针包括SEQIDN0.3所示的序列，SEQIDN0.3所示的序 列为5 ' -ATGAGAATTTTGAGGGAGAATCAATAAACTATT-3 '。
[0014]进一步，所述MCR-1探针的5'端结合有荧光标记物，所述MCR-1探针的3'端结合有 淬灭剂。
[0015] 优选地，MCR-1探针为SEQID獻3所示的序列，并且具有下列结构式：5'-焚光基 团/GTTTGCCAAATTCACGCCAGTGTGTG/淬灭基团-3 '。
[0016] 上述探针可选用下述任一荧光基团在其5'端标记，例如:FAM、VIC、TET、JOE、HEX、 CY3、CY5、R0X、RED610、TEXAS RED、RED670、NED;选用下述任一淬灭基团在其3'端标记，例 如：6_TAMRA、BHQ_1~3、和结合分子沟的非突光粹灭剂（Minor Groove Binder nonf luorescent quencher,MGBNFQ)〇
[0017] 优选地，所述的SEQIDNO·3的5'端标有焚光基团FAM，SEQIDNO·3的3'端标有淬 灭基团BHQ-1。
[0018]本发明提供一种用于检测细菌MCR-1基因的试剂盒，包括上述的引物对和上述的 MCR-1探针。
[0019 ]进一步，还包括内标引物对和内控探针；
[0020]所述内标引物对为用于扩增E.coli标准品的引物对；
[0021]所述内控探针为与用于扩增E.coli标准品的引物对匹配的E.coli探针；
[0022] 所述E.coli标准品序列为SEQIDN0.8所示，SEQIDN0.8所示的核苷酸序列具体 为：
[0024] 扩增E.coli标准品的上游引物包括SEQIDN0.4所示的序列，SEQIDN0.4所示的 序列为5 ' -TCTTACCCTAGTACATGGAGTAATGTTG-3 '，优选地，扩增E.coli标准品的上游引物为SEQIDN0.4所示的序列；
[0025] 扩增E.coli标准品的下游引物包括SEQ IDN0.5所示的序列，SEQ IDN0.5所示的 序列为5'-GCATGTTCTGGTACCAAATAATCCGTGA-3'，优选地，扩增E. co 1 i标准品的下游引物为SEQ IDN0.5所示的序列；
[0026] E.coli探针包括SEQIDN0.6所示的序列，优选地，E.coli探针为SEQIDN0.6所 示的序列，SEQIDN0.6所示的序列为5'-CGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACG-3'，在该序列的 5'端结合有荧光基团，在该序列的3'端结合有淬灭基团。
[0027]用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至200bp的范围中，这可以使得能够 在短时间内特异性基因。上述探针可选用下述任一荧光基团在其5'端标记，例如:FAM、VIC、 TET、JOE、HEX、CY3、CY5、R0X、RED610、TEXAS RED、RED670、NED;选用下述任一淬灭基团在其 3'端标记，例如:6-TAMRA、BHQ-l~3、和结合分子沟的非突光粹灭剂(Minor Groove Binder nonf luorescent quencher,MGBNFQ)〇
[0028] 优选地，所述的SEQ ID NO.6的5'端标有荧光基团HEX，SEQ ID NO.6的3'端标有淬 灭基团BHQ-1。
[0029] 进一步，还包括PCR反应混合液和TaqDNA聚合酶;所述的PCR反应混合液包括以下 组分:Buf f er 10X缓冲液8yL、检测MCR-1基因的上游引物0.6μΜ、检测MCR-1基因的下游引 物0.6μΜ、MCR-1探针0.3μΜ、扩增E.co 1 i标准品的上游引物0.6μΜ、扩增E.co 1 i标准品的下游 引物0.6μΜ、内控探针0.3μΜ、dNTP各组分0.8mM。
[0030] 进一步，还包括阳性对照品和阴性对照品；
[0031 ]所述的阳性对照品为包含MCR-1被检测片段的质粒，浓度为103拷贝ΛΛ;
[0032]所述的阴性对照品为浓度为0.9% (氯化钠的质量与生理盐水的体积的百分比）的 生理盐水。
[0033]进一步，所述MCR-1被检测片段包括SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列，具体序列为：
[0035]上述的引物对、探针、以及试剂盒在细菌MCR-1基因的诊断或辅助性诊断中具有很 好的应用。
[0036]对于样本，可以为粪便、尿液、汗液、脓液、脑积水、血液、痰液、鼻咽拭子等可能含 有MCR-1耐药基因的样本来源;所述待测样本为从样本中提取的DNA。
[0037] 本发明中，MCR-1细菌具体可以为大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、难辨梭菌、金黄色葡 萄球菌、淋球菌等可能携带MCR-1基因的微生物。
[0038] -种用于检测细菌MCR-1基因的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0039] 将5yL待测样本、0.6yL TaqDNA聚合酶与34.4yLPCR反应混合液进行混合均匀，所 述的PCR反应混合液包括以下组分:Buffer10X缓冲液8yL、检测MCR-1基因的上游引物0.6μΜ、检测MCR-1基因的下游引物0.6μΜ、MCR-1探针0.3μΜ、扩增E.co1i标准品的上游引物0.6μ Μ、扩增E.co1i标准品的下游引物0.6μΜ、内控探针0.3μΜ、dNTP各组分0.8mM;
[0040]按照下面条件进行扩增：
[0042] 即第一阶段:94°C5分钟；第二阶段:94°C20秒、58°C30秒，10个循环;第三阶段:94 °C20秒、58°