用于神经细胞培养的培养基组合物的制作方法
【专利说明】用于神经细胞培养的培养基组合物
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2013年4月17日提交的美国申请第61/813,034号的优先权及其权 益，其全部内容通过引用的方式全部并入。
【背景技术】
[0003] 对干细胞和体细胞重编程以对人类疾病进行建模并找到迫切需要的疗法投入大 量希望和努力。最近的诺贝尔医学及生理学奖在人类体细胞重编程为多能干细胞的革命性 方法发表5年后就授予给Yamanaka博士，说明有多少希望给予在诱导多能干细胞（IPSC) 技术上（Takahashi等人，2007)。之后不久，即表明得自患者皮肤细胞的IPSC可以在体外 转变为神经元（Dimos等人，2008)。神经科学的科学家们涌入这个前所未有的机会以在体 外获得得自神经和精神障碍患者的活神经元培养物并证实与特定障碍相关的主要表型可 以在培养皿上显现（Marchetto 等人·，2010 ;Brennand 等人 2011 ;Marchetto 等人 2011 ; Nguyen 等人 2011 ;Seibler 等人 2011 ;Bellin 等人 2012 ;Egawa 等人 2012 ;Israel 等人 2012 ;Shi 等人 2012)。
[0004] 然而还没有用完整的神经生理学方法建立使神经元体外生长的基本培养条 件。当前，几乎所有人类神经元培养物均在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM)中生 长（Cattaneo and McKay, 1990 ;0kabe 等人，1996 ;Soldner 等人，2009 ;Vierbuchen 等 人，2010 ;Brennand 等人，2011 ;Caiazzo 等人，2011 ;Eiraku 等人，2011 ;Marchetto 等 人，2011 ;Nguyen 等人，2011 ;Pang 等人，2011 ;Pfisterer 等人，2011 ;Qiang 等人，2011 ; Soldner 等人，2011 ;Son 等人，2011 ;Boyer 等人，2012 ;Br0z 等人，2012 ;Giorgetti 等 人，2012 ;Israel 等人，2012 ;Shao 等人，2012 ;Vilchez 等人，2012)，偶有在Neurobasal 培 养基（Hermann 等人，2004 ;Li 等人，2005 ;Johnson 等人，2007)或 DMEM 和 Neurobasal 的 混合物（Koch 等人，2009 ;Boulting 等人，2011 ;Kriks 等人，2011 ;Egawa 等人，2012 ;Shi 等人，2012)中生长。之后将多种生长因子和补充物添加到基础培养基中以促进神经元分 化和成活。使用膜片钳和钙成像技术，发明人发现，广泛使用的那些基础培养基完全没有针 对神经生理学功能进行调整。它们严重地损害了动作电位放电以及兴奋性和抑制性突触功 能，其从而使自发的神经活动急剧降低。这进而又对功能发育和体外神经元操作具有不利 后果。因而，领域内需要一种培养基组合物，其密切反映体内生理条件以提供例如成熟神经 细胞、神经祖细胞或原代神经细胞的体外分化、扩张或维持过程中的未被折衷的条件。
[0005] 本文在其他之外特别提供可用于培养神经细胞的培养基组合物。具体而言，本文 提供的组合物模拟活脑中的重要生理条件并保持神经活性。在一些实施方式中，本文提供 的培养基组合物改进长期体外培养中人神经元分化的效率并促进突触功能。
【发明内容】
[0006] 本申请提供一种细胞培养基，其促进在该培养基中培养的脑细胞的生长和/或保 持和/或功能活性。在某些实施方式中，细胞培养基包含一种或多种神经活性无机盐、和/ 或一种或多种神经活性氨基酸、和/或一种或多种维生素、和/或一种或多种氨基酸、和/ 或一种或多种能量基质（energetic substrate)、和/或一种或多种pH调节剂。
[0007] 在某些实施方式中，培养基包含浓度为约70mM~约150mM的氯化钠、浓度为约 0.0 OOOOlmM~约10mM的神经活性无机盐、浓度为约0.0 OOlmM~约0. 05mM的甘氨酸、浓度 为约0.0 OOlmM~约0. 05mM的L-丙氨酸、和浓度为约0.0 OlmM~约0. 03mM的L-丝氨酸。
[0008] 在某些实施方式中，培养基包含浓度低于约0. 05mM的L-丙氨酸、浓度低于约 0. 25mM的甘氨酸、浓度低于约0. 25mM的L-丝氨酸、浓度低于约0. 15mM的L-脯氨酸、浓度 低于约0. 60mM的L-精氨酸盐酸盐、浓度低于约2. 5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、浓度高 于约0. 41mM的硫酸镁、浓度高于约1. 05mM的氯化f丐、浓度高于约4. 16mM的氯化钾、浓度高 于约120. 7mM的氯化钠、浓度低于约17. 5mM的D-葡萄糖或浓度为约5mM的HEPES。
[0009] 在某些实施方式中，本申请提供包含一种或多种神经活性无机盐和一种或多种神 经活性氨基酸的培养基。在某些实施方式中，培养基还包含一种或多种pH调节剂、一种或 多种能量基质、一种或多种氨基酸、和/或一种或多种维生素、及其组合。在某些实施方式 中，培养基的成分以促进在培养基中培养的神经细胞的生长、维持和神经功能性的量存在。
[0010] 在某些实施方式中，培养基不包含血清。
[0011] 在某些实施方式中，培养基包含一种或多种能量敏感型成分，其中，该成分与能量 源例如光或电的接触使得在培养基中培养的神经细胞的活性增加。在某些实施方式中，该 成分持续暴露于能量源引起培养基中培养的神经细胞的兴奋毒性。
[0012] 在另一方面，提供培养神经细胞的方法。该方法包括，使神经细胞与本文（包括其 实施方式）提供的培养基接触，并使得神经细胞生长，从而培养神经细胞。
[0013] 在另一方面，提供在本文（包括其实施方式）提供的培养基中培养的哺乳动物细 胞。
【附图说明】
[0014] 图1A-C :DMEM或Neurobasal基培养基损害神经和突触活性。将iPS或ES细胞来 源的人类神经元直接在玻璃盖玻片上铺板。将单个成熟神经元的基础神经元功能在两个经 典细胞外基础培养基（DMEM/F12或Neurobasal-A)中测试并比较。将细胞外培养基的灌注 从ACSF切换到DMEM/F12或Neurobasal-A，并换回ACSF以进行恢复。A.钙成像分析示出在 ACSF、DMEM/F12并回到ACSF中记录的同一视野的1 Omin视频中自发活性细胞的数量。ACSF 的无机盐浓度和摩尔渗透压浓度与DMEM匹配。灰线表示各个视野。统计用Wilcoxon测试 进行，= 0. 009, *P = 0. 022)。B.顶部追踪痕迹:电流钳记录揭示出在ACSF中观察到 的自发动作电位在DMEM中快速消失，伴随有静息膜电位的较大增加。中间追踪痕迹:电压 钳记录（于70mV，C1-逆转电位）表明DMEM基培养基引发较大的Na+内向电流并完全阻断 自发的AMPA突触活性。底部追踪痕迹:电压钳记录（于OmV，Na+逆转电位）示出DMEM基 培养基引发较大的C1-电流并完全阻断自发的GABA突触活性。C.顶部追踪痕迹（突触活 性）:电位钳记录示出Neurobasal-A基培养基强烈地降低自发的AMPA突触活性。此外，其 也引发较大的紧张性C1-电流并完全阻断自发的GABA突触活性。底部追踪痕迹（动作电 位）：NB-A并不影响静息膜电位佰其强烈地破坏诱发动作电位(电流阶跃500ms)、电压依 赖的Nav/Kv电流（IV追踪痕迹，钳-70mV，电压阶跃5mV)和自发动作电位。
[0015] 图2A-G :BrainPhys支持高效的动作电位活性。A.尽管电压门控电流的峰值可以 在单个神经元之间有变化，它们在BrainPhys和ACSF中是相似的。各个神经元均在ACSF 和BrainPhys中测试（黑色vs.蓝色点）。非参配对Wilcoxon检验P值以斜体示出。柱 状图表示均值土标准误。B.静息膜电位、自发和诱发动作电位在ACSF和BrainPhys中相 同。C.膜片钳处理的典型成熟神经元表达光基因（optogene)(突触蛋白：Cheta-YFP)并填 充有若丹明。神经元活性的光基因控制可以可靠地在BrainPhys中实现。D.在BrainPhys 或Neurobasal-A中以相同参数测试的单个成熟神经元表明，光基因控制在BrainPhys中 得到显著改善。E.单个神经元的电压门控Nav和Kv电流的最大振幅（由IV曲线测定的， 钳-70mV，阶跃5mV)与BrainPhys (蓝色点）或ACSF (黑色点）相比在Neurobasal培养基 中（红色点=Neurobasal_A，橘色点=Neurobasal)显著减少。F.兴奋性（AMPA)和抑制 性（GABA)突触活性在BrainPhys培养基中均很明显。在记录单个神经元的自发突触活性 的同时灌注不同培养基表明与其他培养基例如Neurobasal-A相比，BrainPhys更好地支持 突触功能。十二次扫描以灰色叠印，且为清楚起见，其中之一以黑色突出显示。G.在ACSF 和BrainPhys的存在下，以钙成像在网络水平测试的自发活性。
[0016] 图3A-D :健康、成熟且有活力的神经元在BrainPhys基培养基中的培养。A.在具 有补充物的BrainPhys中生长超过4周的人IPSC来源的典型神经元培养物的免疫染色。 B-C.在BrainPhys-补充物中成熟3~6周的典型功能性神经元的电生理活性。膜片钳记 录也在BrainPhys培养基中进行。B.从左到右:由较小的500ms去极化电流阶跃或简单的 闪光（syn :Cheta-YFP)诱发的一系列动作电位。IV追踪痕迹（钳-70mV，阶跃5mV)示出典 型的电压依赖的Na+和钾电流。自发动作电位记录在电流钳中。C.由AMPA受体（对NBQX 敏感，电压钳于_70mV)和GABA受体（对Gabazine敏感，电压钳于OmV)介导的自发突触反 应。D.钙成像示出在BrainPhys-补充物中生长并记录的神经网络的常规活性。时间序列 分析对于目标活性区进行做图。
[0017] 图4A-J :与基于DMEM/H2或Neurobasal培养基相比，在BrainPhys培养基中培 养的人神经元的特征。A-G.在三个并排生长的培养物中观察到的代表性免疫染色。细胞 核用DAPI染色（蓝色）。尽管存在一些不同，在人神经元的存活、神经元亚型（例如，多巴 胺能的、Gaba能的）的比例以及近端突触斑（synaptic puncta)的数量方面没有明显的 差异。H.神经元的功能类型基于其响应于500ms电流去极化阶跃时的放电模式而进行界 定。I.为将BrainPhys对功能性成熟的影响进行表征，将神经元在相同培养板中培养于 BrainPhys或DMEM/F12基培养基中。膜片钳在ACSF中用盲法进行。在BrainPhys培养物 中发现更高比例的成熟5型神经元。BrainPhys培养物也示出更高比例的接收功能性AMPA 突触输入（NBQX敏感的）或GABA突触输入（Gabazine敏感的）的神经元（3、4和5型），其 由在电压钳（分别为_70mV或OmV)4min记录中以不同动力学具有至少5个自发突触反应 而确定。J.不同iPS细胞系来源并在ACSF中膜片钳处理的较多神经元样本的进一步分析 证实，在基于BrainPhys的培养基中的培养神经元在相当程度上增加获得有突触活性的神 经元的机会。
[0018] 图5A-C :基于BrainPhys的神经元培养基允许有效直接的神经元转化（iN)以及 人iN细胞的功能性成熟并增加 ARC蛋白表达。A.实验设计：能够iN的HDF在NC培养基中 转化三周。对于成熟，将iN细胞迀移至星形细胞上并进一步在匪培养基中培养。B.在3 周转化后，对于β-ΙΙΙ-微管蛋白、hTau、MAP2ab和NeuN进行免疫荧光染色。标尺：50μπι。 C.在星形细胞上成熟后的6周龄iN细胞中hTau和ARC的免疫荧光染色的代表性图片和分 析。在ImageJ中使用ROI选择进行的定量和测量。标尺：100μπι。在得自三个供体的iN 培养物中的神经元ARC水平的定量。灰色点代表各个细胞（平均η = 38/组，最小η = 19/ 组）。条状物示出各组的均值土SEM。*Ρ〈0· 05, #Ρ〈0· 01，*#Ρ〈(λ 001，##Ρ〈(λ 0001。
[0019] 图6A-C示出使用多电极阵列（ΜΕΑ)在数周中对BrainPhys中人神经元的电活性 的测试，并与当前所用的条件比较。BrainPhys提高长期神经元活性。A.向成熟培养基中 添加血清（例如，血清替代物（knockout serum)，胎牛血清FBS)强烈地破坏神经元功能。 B.与所测试的NB/DMEMF12混合物或DMEM/F12相比，BrainPhys减少由饲养循环引起的变 化性并且改善和保持长期神经元功能。C.与具有相同的不含血清的补充物的iCell神经元 培养基或Neurobasal相比，经补充但不含血清的BrainPhys在数周中改善并保持神经元活 性。
[0020] 图7A-C :示出并在BrainPhys-补充物中培养的帕金森患者iPSC来源的神经元的 活性。A.示出iPSC来源神经元的生成的图。B.帕金森患者iPSC来源的有活性的活脑细 胞在于BrainPhys中培养后进行TUJ-1和GFAP染色。C.健康受试者和帕金森患者的神经 元细胞的活性。
[0021] 图8A-G :健康和有活性的大鼠原代海马神经元在BrainPhys中的分化。A-G.在 BrainPhys+补充物（sml)中生长2~3周的典型功能性神经元的电生理活性。A.图表示 出来自大鼠海马的原代神经元在BrainPhys+sml中培养2周多，之后进行功能分析。B.填 充有若丹明的典型膜片钳处理的神经元的图像。在右边，较亮的白色阴影为若丹明填充的 膜片钳电极。C.由较小的500ms去极化电流阶跃诱发的一些列动作电位，且IV追踪痕迹 (钳-70mV，阶跃5mV)示出典型的电压-依赖的Na+和K+电流。着色的追踪痕迹与不同的 电压阶跃对应。D.在电流钳中记录的自发动作电位。E.在电压钳（OmV)记录的自发GABA 突触反应。F.在电压钳（_70mV)中记录的自发AMPA突触反应。G.在膜片钳和免疫组化操 作后固定盖玻片。用MAP2对树突染色，用突触蛋白对突触前末梢染色，并用DAPI对细胞核 染色。
[0022] 图9A-C :DMHM使每一个被检测神经元的膜电位去极化，在大多数情况中，其也会 使自发动作电位放电饱和并沉默。该追踪痕迹得自对ACSF或DMEM中干细胞来源的人神经 元的全细胞电位钳自发记录。A.DMEM没有使动作电位放电饱和并沉默的罕见例子。B-C. 两个其他常规例子，其中DMEM引发的去极化使自发动作电位放电沉默。
[0023] 图10 :DMHM引发较大的C1-电流并阻断自发的抑制性突触活性。常规神经元的电 压钳记录（OmV)示出，在ACSF中的自发GABA突触活性可被DMEM阻断并且可以恢复。顶部 的追踪痕迹表示常规的GABA反应，其在ACSF中但无法在DMEM中看到。底部的追踪痕迹是 改变灌注时相应的连续记录，示出在DMEM灌注发生时的较大C1-流以及后续的平稳期。
[0024] 图11A-D :移除培养基的所有维生素、所有氨基酸或所有额外组分的DMEM。通过移 除大量氨基酸，DMEM引发的造成DMEM中动作电位和突触活性破坏的去极化被避免。然而， 该溶液无法在长于一周的时间中保持神经元的发育和存活。
[0025] 图12 :向BrainPhys基础培养基急性地（acutely)添加完整一套的常用补充物 (N2、B27、视黄酸、BDNF、⑶NF、抗坏血酸、cAMP、层粘连蛋白和胆固醇）并不影响放电率或兴 奋性/抑制性突触活性。
[0026] 图13A-C.小鼠脑切片（取自活体）在BrainPhys中的膜片钳记录。A-C. BrainPhys 中得自成年小鼠海马的常规功能性颗粒神经元的膜片钳处理。A.自静息膜电位经500ms电 流阶跃诱发的动作电位。B.示出Nav和Kv电流的增量5mV阶跃（静息-70mV)的IV追踪 痕迹。C.自发AMPA突触反应（电位钳-70mV)。
[0027] 图14A-B :Neurobasal引起较大的C1-电流并阻断自发的抑制性突触活性。
【具体实施方式】
[0028] 本公开至少部分基于促进在培养基中培养的神经细胞的生长和维持以及功能活 性的培养基的发现。具体而言，本申请公开了，该培养基可以包含神经活性无机盐、神经活 性氨基酸、pH调节剂、能量基质、氨基酸和维生素的组合。在某些实施方式中，培养基的成 分以促进在培养基中培养的神经细胞的生长、维持和神经功能性的量存在。
[0029] I.宙义
[0030] 除非另外指出，本文所用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解 相同的含义。参见，例如，Singleton 等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed.，J.Wiley&Sons (New York，NY 1994) ;Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, NY 1989)。与本文所述的那些相似或等同的任何方法、装置和材料可以用在本发明的实施中。 提供以下定义帮助对本文常用的某些术语的理解，并不意在限制本公开的范围。
[0031] 术语"氨基酸"是指天然存在的以及合成的氨基酸，以及以与天然存在氨基酸相似 的方式进行作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的 那些，以及在之后进行修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ -羧基谷氨酸和〇-磷酸丝氨 酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、 羧基、氨基以及R基连接的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基 锍。这些类似物具有修饰的R基（例如，正亮氨酸）或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在 的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构、但 以与天然存在氨基酸相似的方式进行作用的化合物。术语"非天然存在的氨基酸"和"非天 然氨基酸"是指无法在自然界找到的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
[0032] 氨基酸在本文中可以用它们通常已知的三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命 名委员会建议的单字母符号进行指代。同样地，核苷酸可以通过其一般认可的单字母代码 进行指代。
[0033] "细胞培养物"是存在于生物体外部的体外细胞群。细胞培养物可以由分离自细胞 库或动物的原代细胞建立、或由得自这些来源中的一种并在长期体外培养中永生化的次生 细胞建立。
[0034] 当提及细胞培养物自身或其培养操作时，术语"培养"、"生长"、"保持"、"扩张"等 可以互换地用于表示细胞在适合于成活的条件下在体外保持（例如，离体的（ex vivo))。 培养的细胞可以存活，并且培养可以引起细胞生长、分化或分裂。术语并不暗示着培养物中 的所有细胞均存活或生长或分裂，因为有一些可能自然衰老等。细胞通常在培养基中培养， 培养基可以在培养过程中变化。
[0035] 术语"介质"、"培养基"和"培养溶液"是指细胞培养环境。培养基通常为等渗溶 液，并且可以是液体、胶状或半固体，例如，提供用于细胞粘附或支持的基质。本文所用的培 养基可以包含培养细胞所需的营养、化学和结构支撑的组分。
[0036] 如本文所用，在培养等中的"允许生长的条件"是指在合适的培养基中（包含盐、 缓冲剂、血清）使得细胞能够进行细胞分裂或至少保持存活至少24小时、优选更长时间 (例如，数天、数周或数月）的温度（对于哺乳动物细胞通常为约37°C )、湿度、C02(通常为 约5%)的条件。
[0037] 当提及细胞或生物样本时，术语"源自"表明细胞或样本在某些时间点从所述的来 源获得。例如，源自个体的细胞可以表示直接从个体获得的原代细胞（即，未修饰的），或者 可以例如通过引入重组载体、通过在特定条件下培养、或永生化