一种制备高纯度米尔贝肟的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物制药领域，涉及一种动物用抗生素的生产方法，尤其涉及一种制 备高纯度米尔贝肟的方法。
【背景技术】
[0002] 米尔贝厢（milbemycinoxime)是一种新型的半合成的大环内酯类驱虫药物，是米 尔贝霉素A3和A4的肟化衍生物，对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通 常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。
[0003] 米尔贝A3肟和米尔贝A4肟的化学结构式如下：
[0004]
[0005]目前米尔贝肟主要是通过发酵得到的米尔贝霉素半合成来得到，但是米尔贝霉素 发酵液单位普遍不高，产品的含量较低，组份杂质多，分离困难。这给制备高纯度的米尔贝 肟带来了很大的难度。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种适用于工业化大生产的高纯度米尔贝肟的制备方法。
[0007] 本发明的制备高纯度米尔贝肟的方法，包括以下步骤：
[0008] 1)将含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的发酵液进行固液分离，然后用第 一溶媒萃取菌渣，得到含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的提取液；
[0009] 2)将提取液浓缩后上硅胶柱层析，并用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液进行洗 脱，得到含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的解吸液；
[0010] 3)将解吸液浓缩，去除溶剂，然后用二氯甲烷溶解浓缩物并进行氧化反应，得到含 有米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的二氯甲烷溶液；
[0011] 4)将步骤3)得到的溶液经活性炭吸附脱色后进行浓缩，浓缩物用第一溶媒溶解， 上硅胶柱层析，用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液进行洗脱，得到含有米尔贝霉素A3酮和 米尔贝霉素A4酮组份的解吸液，然后浓缩结晶，分离出结晶体；
[0012] 5)对结晶体进行肟化反应，加入水终止反应后加入二氯甲烷萃取，得到含有米尔 贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的二氯甲烷溶液；
[0013] 6)将上述的含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的二氯甲烷溶液去除溶剂， 用第三溶媒的水溶液溶解，进行树脂层析，然后将解吸液按照米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉 素A4肟含量比例为1:4进行混合，得到解吸混合液；
[0014] 7)用庚烷萃取解吸混合液，得到含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的庚烷 溶液，然后去除溶剂，再用第三溶媒溶解，加水降温进行结晶，固液分离、干燥得到米尔贝肟 晶体。
[0015] 上述步骤1)的发酵液是通过现有技术进行菌种发酵培养得到的含有米尔贝霉素 A3和A4组份的发酵液；所述第一溶媒可以是庚烷或甲苯，优选庚烷；萃取溶媒用量优选为 菌渣重量的8~10倍；萃取温度以30~40°C为宜。
[0016] 上述步骤2)将提取液浓缩至米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的浓度为10~ 15g/L，并通过除菌板除菌后再上硅胶柱；其中所述除菌板的孔径为0. 2~0. 45μm;所使用 的硅胶为工业级层析硅胶，粒径为100~400目，干硅胶粉末的使用重量优选为米尔贝霉素 A3和米尔贝霉素A4组份净含量重量的50~100倍；所述第二溶媒可以是丙酮或丁酮，优 选丙酮；第一溶媒和第二溶媒混合的比例优选为第一溶媒体积（V):第二溶媒体积（V)= 80:20 ~95:5〇
[0017]上述步骤3)氧化反应使用的氧化剂可以是活性二氧化锰、氯铬酸吡啶盐（PCC)、 重铬酸吡啶盐（roc)等；更优选活性二氧化锰。
[0018] 上述步骤4)中使用的活性炭优选针用活性炭；活性炭的加入量为米尔贝霉素A3 酮和米尔贝霉素A4酮总量的2~3倍（质量）；活性炭加入后保持二氯甲烷溶液的温度范 围为30~35°C搅拌1~2小时，然后通过除菌板去除活性炭粉末，得到澄清的含有米尔贝 霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的二氯甲烷溶液。将澄清的含有米尔贝霉素A3酮和米尔贝 霉素A4酮的二氯甲烷溶液浓缩去除溶剂后，用第一溶媒溶解，上硅胶柱层析，所述硅胶为 工业级层析硅胶，粒径为100~400目，干硅胶粉末的使用量为米尔贝霉素A3酮和米尔贝 霉素A4酮组份重量的50~100倍；洗脱所用的混合溶媒中第一溶媒体积（V):第二溶媒 体积（V) = 5:1 ~11:1。
[0019] 上述步骤5)肟化反应可以是：将米尔贝霉素酮结晶体用无水乙醇完全溶解后， 将盐酸羟胺的水溶液缓慢加入该米尔贝霉素酮乙醇溶液中，搅拌混合同时保持溶液温度为 20~25°C，反应1小时以上，直到米尔贝霉素酮完全转变成米尔贝霉素肟后终止反应。
[0020] 上述步骤6)中所述第三溶媒优选为乙醇或甲醇，更优选甲醇；树脂层析所使用的 上柱液为第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的体积百分含量为55%~60%;树脂层析所使 用的解吸液也是第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的体积百分含量为60%~70%且高于 上柱液的含量；所使用的树脂优选为苯乙烯-聚苯乙烯系列的非极性大孔树脂。
[0021] 上述步骤7)先在解吸混合液中加入两倍解吸混合液体积的水，再用庚烷进行萃 取，得到含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的庚烷溶液；然后将上述庚烷溶液去除溶 剂后加入第三溶媒进行溶解，得到米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟总浓度为20g/L~ 50g/L的溶液；再缓慢加入体积为第三溶媒体积3~4倍的水，降低溶液温度到10~20°C， 缓慢搅拌结晶；最后固液分离、真空干燥得到含高纯度米尔贝肟的结晶体。
[0022] 本发明提供了一种较简单的纯化方式得到高纯度的米尔贝肟，非常适用于工业化 大生产。组份我们在研究过程中惊喜的发现通米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的混合 物，在使用氧化活性较低的氧化剂氧化后，通过一次硅胶层析，米尔贝霉素A3酮和米尔贝 霉素A4酮的含量轻松的由不到25%提高到了 75%以上，且在氧化酮解吸液的浓缩过程中 米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮会自然析出结晶，产品的含量再次上升到95%以上，通 过树脂层析调整米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的含量比例的同时能够再次将产品的 含量提高到98%以上。整个工艺比较简单，对设备要求较低，通用性好，无需太大的改造，可 以快速进行工业化大生产。
【具体实施方式】
[0023] 以下通过【具体实施方式】对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本 领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明 的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0024] 下列实施例中，为了方便描述，将米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4产品之和称为 "米尔贝霉素组份";将米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮产品之和称为"米尔贝酮组份"； 将米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟产品之和称为"米尔贝肟组份"。
[0025] 实施例1
[0026] 对含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的发酵液进行板框压滤，菌渣用8倍 菌渣重量的甲苯萃取，得到的甲苯萃取液经过高压液色谱相检测计算含米尔贝霉素组份 100g。浓缩甲苯萃取液，直到甲苯中米尔贝霉素组份的含量为15g/L，甲苯萃取浓缩液通过 0. 45μm孔径的除菌板过滤。
[0027] 过滤后的甲苯萃取液进行硅胶上柱。硅胶柱由5kg的干硅胶装填而成，硅胶粒径 为100~200目。上柱完成后用甲苯：丙酮=95:5(V/V)的解吸液对硅胶柱进行解析。合 并解吸液，得到的解吸液含有米尔贝霉素组份90g，取小部分解吸液浓缩干，通过高压液相 色谱检测计算米尔贝霉素组份在浓缩物中的质量含量为20 %。
[0028] 将米尔贝霉素组份的解吸液减压浓缩干，回收溶剂，浓缩物用二氯甲烷溶解，投入 活性二氧化锰氧化，直到高压液相色谱检测所有米尔贝霉素组份氧化成米尔贝酮组份后将 二氯甲烷中的活性二氧化锰过滤去除。得到二氯甲烷溶液含米尔贝酮组份86g。向二氯甲 烷溶液投入针用活性炭258g，水浴35°C下搅拌2小时，通过除菌板过滤去除活性炭。过滤 后的二氯甲烷米尔贝酮组份溶液，浓缩干回收二氯甲烷后用甲苯溶解浓缩物。
[0029] 用8. 6kg重量的干硅胶在甲苯中浸泡后装填层析柱。含有米尔贝酮组份的甲苯溶 液上柱后，用甲苯：丙酮=11:1(V/V)的解吸液对硅胶柱进行解吸，收集含有米尔贝酮组 份的解吸液，得到含有米尔贝酮组份76g的解吸液混合液。浓缩解吸液过程中结晶，离心机 分离结晶体68g，高压液相色谱检测后计算其中含米尔贝酮组份65g。
[0030] 将米尔贝酮结晶体用1760mL无水乙醇溶解，称取163. 2g盐酸羟胺用163mL纯化 水溶解完全，将盐酸羟胺水溶液缓慢加入米尔贝酮乙醇溶液中，搅拌并保持溶液20°C，加入 完1小时后取样，用高压液相色谱检测，米尔贝酮反应完全，立即加入水终止反应，并用二 氯甲烷萃取，得到含有米尔贝肟组份的二氯甲烷溶液，通过高压液相色谱检测计算二氯甲 烷溶液中含有米尔贝肟63g。
[0031] 浓缩干二氯甲烷溶液，用甲醇溶液溶解浓缩物，再向其中缓慢加入水，使其甲醇的 体积百分比降低为60%，用上海华震色谱-3树脂进行层析，上柱完成后用甲醇的体积百分 比为70%的甲醇水溶液进行解析，收集含有米尔贝肟的解吸液，通过高压液相色谱检测调 整混合解吸液中米尔贝霉素A3肟色谱含量和米尔贝霉素A4肟组份色谱含量比例=1: 4。 解吸液中加入2倍解吸液体积的水，并用庚烷萃取，通过高压液相色谱检测计算庚烷溶液 中含有米尔贝肟组份50g
[0032] 浓缩干并回收庚烷，用2. 5L甲醇溶解浓缩物，再向其中缓慢加入10L纯化水，降低 温度到20C结晶。
[0033] 离心分离结晶物，真空干燥得到米尔贝肟结晶体48g，通过高压液相色谱检测其中 米尔贝肟组份质量百分含量为98. 3%。
[0034] 实施例2
[0035] 对含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的发酵液进行板框压滤，菌渣用10 倍菌渣重量的庚烷萃取，得到的庚烷萃取液经过高压液相色谱检测计算含米尔贝霉素组份 120g。浓缩庚烷萃取液，直到庚烷中米尔贝霉素组份的含量为10g/L，庚烷萃取浓缩液通过 0.2μπι孔径的除菌板过滤。
[0036] 过滤后的庚烷萃取液进行硅胶上柱。硅胶柱由12kg的干硅胶装填而成，硅胶粒径 为300~400目。上柱完成后用庚烷：丁酮= 80:20 (V/V)的解吸液对硅胶柱进行解析。合 并解吸液，得到的解吸液含有米尔贝霉