治疗骨质疏松的α-螺旋多肽及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及治疗性多肽领域，具体涉及新型长效ΡΤΗ(1-34)肽衍生物及其制备方 法，同时还涉及这些衍生物的医疗用途。
【背景技术】
[0002] ΡΤΗ(1-34)是人体甲状旁腺激素(ΡΤΗΗ-34氨基酸片段，可以作为治疗骨质疏松症 促骨形成药物，能够直接刺激成骨细胞，增加骨密度，降低骨折的风险。序列结构为:S-V-S-Ε-Ι-Q-L-M-H-N-L-G-K-H-L-N-S-M-E-R-V-E-W-L-R-K-K-L-Q-D-V-H-N-F-NH2，长期以来，人 们花大量精力来研究抗骨吸收药物，然而骨吸收一旦被抑制或减弱，则骨重建的机会就减 少了，这是因为骨重建中新骨的形成位置正是骨质吸收的位置，骨吸收部位的减少意味着 骨形成部位的减少。相反，作为骨形成刺激药物的ΡΤΗ(1-34)主要通过增加成骨细胞数量和 抑制成骨细胞的凋亡方式，直接刺激骨形成，提高骨密度，增加骨转化和骨重建，从而达到 治疗骨质疏松的作用。与其他药物相比，ΡΤΗ(1-34)组骨转化能力更强，并且可以显著降低 骨质疏松性骨折的风险，并且不良反应少见。因此，ΡΤΗ是现今骨质疏松症治疗最有前景的 药物。目前获得FDA批准的第一个用于骨质疏松症治疗的促进骨形成药物是特立帕肽 (Teriparatide)。特立帕肽是甲状旁腺激素1-34氨基酸片段:ΡΤΗ(1-34)，保留了甲状旁腺 激素的生物活性，并且避免了 C端对骨代谢的不良影响。特立帕肽ΡΤΗ(1-34)非常适合治疗 原发性骨质疏松症，不受性别影响。
[0003] 尽管相比于其他治疗骨质疏松症的药物，ΡΤΗ(1_34)药效好，副作用少，非常具有 前景。但是ΡΤΗ(1-34)也有不少缺点：由于ΡΤΗ( 1 -34)容易被胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶 在五分钟内降解掉，不能通过口服，目前主要通过每日皮下注射给药，非常麻烦;ΡΤΗ( 1-34) 的半衰期很短，血浆半衰期只有不到30分钟，相对于其昂贵的价格(特立帕肽注射液大约 6000元一支），治疗成本非常高。因此，对ΡΤΗ( 1-34)进行修饰改造，克服它原有的缺点是很 有必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是针对临床上ΡΤΗ(1_34)在体内半衰期短，需要频繁注射给药 的缺陷，提供一种作用时间更长、疗效更好的ΡΤΗ(1_34)衍生物。
[0005] 本发明的另一个目的是提供该ΡΤΗ( 1-34)衍生物的制备方法。
[0006] 本发明的又一个目的是提供该ΡΤΗ(1-34)衍生物在治疗/预防骨质疏松症的药物 中的应用。本发明还涉及到一种药物，以所述ΡΤΗ( 1-34)衍生物为活性成分，用于治疗/预防 骨质疏松症。
[0007] 通过对ΡΤΗ与其受体蛋白ΡΤΗΙ的结合方式与结合位点的研究表明，ΡΤΗ(1-34)与 ΡΤΗ I受体主要通过疏水相互作用结合。ΡΤΗ(1-34)的6个氨基酸残基(V21、W23、L24、L28、 V31和F34)形成了的α-螺旋的疏水面，紧紧插入由3层PTH IR的胞外结构域(ECD)折叠形成 的疏水槽中。此外，ΡΤΗ(1-34)上的氨基酸残基V31有稳定α-螺旋的作用；氨基酸残基Ν16与 R20分别与PTH I受体的相应氨基酸残基形成一对和两对氢键相互作用，并且R20也是PTH (1-34)与PTH I受体R有特异性结合能力的关键氨基酸。由此可见，PTH( 1-31)上氨基酸残 基:附6、1?20、￥21、123、1^4、1^8、￥31和？34为？1'!1(1-34)与？1'!11受体结合作用的关键氨基酸 残基位点。同时这种α_螺旋结构对于保持其生物活性极为重要。然而化学合成的多肽通常 都是一段无序结构，很难保持其在生理条件下的二级结构。因此，通过发展合适的化学修饰 方法，来稳定合成多肽的α-螺旋结构，一方面可以增强其与受体的亲和力，另一方面，还能 大幅提升多肽的抗蛋白水解能力，这种方法在多肽药物改造方面具有重要的潜在应用价 值。通常可以通过在多肽序列合适的位置侧链成环的方式来稳定多肽的α-螺旋结构，侧链 一般在多肽α_螺旋的同一面上，侧链氨基酸的位置一般为i/i+3，i/i+4，i/i+7，i/i+ll等， 其中应用较多的是i/i+4和i/i+7。
[0008] 本发明以ΡΤΗ(1-34)为模板，用Cys替换i/i+4、i/i+7位置上的氨基酸，然后通过连 接臂侧链成环的策略，来稳定PTH(1_34)的α-螺旋结构。通过这种方法得到的一种PTH(1_ 34)衍生物，在保留良好的体内活性的同时，解决了天然ΡΤΗ(1-34)半衰期短的问题，这种 ΡΤΗ(1-34)衍生物在治疗骨质疏松症药物中具有更大的应用潜力。由此完成了本发明。
[0009] 用于实现上述目的的技术方案如下：一种ΡΤΗ(1-34)衍生物，所述衍生物为在相对 应序列ΡΤΗ(1-34)第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换，然后通过连接臂（linker)成环后 形成的化合物，其中i的取值为15、17、18、20、22、26、27或29。1八+7的位置上的氨基酸也是 用Cys替代，i的取值为19、22或26。所述连接臂（linker)选自化合物1或化合物2,结构式如 下。当连接臂（linker)的结构为化合物1时，对应的PTH( 1-34)衍生物记为2f;当连接臂 (linker)的结构为化合物2时，对应的PTH( 1-34)衍生物记为2b。
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[0012] 当i = 15，位置为i /i +4时，连接臂选用化合物1时；ΡΤΗα -34)衍生物的结构如式 (PTH082f)所示：
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[0014] 当i = 17，位置为i/i +4时，连接臂选用化合物1时;PTH(1 -34)衍生物的结构如式 (PTH092f)所示：
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[0016]当i = 18,位置为i/i+4时，连接臂选用化合物1时;ΡΤΗ(1-34)衍生物的结构如式 (PTH102f)所示：
[0017]
[0018] 当i = 20,位置为i/i+4时，连接臂选用化合物1时；ΡΤΗ(1-34)衍生物的结构如式 (PTH112f)所示：
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[0020] 当i = 22,位置为i/i+4时，连接臂选用化合物1时;PTH(1_34)衍生物的结构如式 (PTH132f)所示：
[0021]
[0022]当i = 25,位置为i/i+4时，连接臂选用化合物1时；PTH(1_34)衍生物的结构如式 (PTH152f)所示：
[0023]
[0024]当i = 26,位置为i/i+4时，连接臂选用化合物1时；PTH(1_34)衍生物的结构如式 (PTH162f)所示：
[0025]
[0026] 当i = 27,位置为i/i+4时，连接臂选用化合物1时;PTH(1_34)衍生物的结构如式 (PTH172f)所示：
[0027]
[0028]当i = 29，位置为i/i +4时，连接臂选用化合物1时；ΡΤΗα-34)衍生物的结构如式 (PTH182f)所示：
[0029]
[0030] 当i = 19，位置为i/i+7时，连接臂选用化合物2时；ΡΤΗ(1-34)衍生物的结构如式 (PTH212b)所示：
[0031]
[0032]当i = 22,位置为i/i+7时，连接臂选用化合物2时;PTH(1_34)衍生物的结构如式 (PTH222b)所示：
[0033]
[0034]当i = 25,位置为i/i+7时，连接臂选用化合物2时；PTH(1_34)衍生物的结构如式 (PTH232b)所示：
[0035]
[0036]当i = 26,位置为i/i+7时，连接臂选用化合物2时；PTH(1_34)衍生物的结构如式 (PTH242b)所示：
[0037]
[0038] 我们发现，与i/i+7位置的钉合相比，i/i+4位置的钉合更能提高多肽ΡΤΗ(1-34)的 螺旋程度，因此是优选方案。在i/i+4位置的钉合中，使用半胱氨酸(Cys)替换ΡΤΗ(1-34) 原肽链中C端氨基酸残基Leul5和Glul9后钉合的构象限定多肽PTH082f，以及使用半胱氨酸 (Cys)替换ΡΤΗ(1-34)原肽链中C端氨基酸残基Metl8和Glu22后钉合的构象限定多肽 PTH102f，对多肽ΡΤΗ(1-34)的α-螺旋程度有显著提高作用，生物活性也有明显提高。在i/i+ 7位置的钉合中，使用半胱氨酸(Cys)替换ΡΤΗ(1-34)原肽链中C端氨基酸残基Glu22和Gln29 后钉合的构象限定多肽PTH222b，相比PTH01生物活性得到了提高。因而这些衍生物都是优 选的方案。
[0039]本发明也提出了上述ΡΤΗ(1-34)衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0040] (1)固相合成相对于序列ΡΤΗ(1-34)第i和i+4或者i和i+7的位置上的氨基酸用Cys 替换的线性多肽；
[0041] (2)步骤(1)得到的Cys替换的线性多肽与连接臂反应成环，经HPLC纯化、冷冻干燥 得到所述的ΡΤΗ(1-34)衍生物。
[0042] 步骤(1)中，先将用于多肽合成的树脂置于固相反应器，再将带保护的氨基酸单体 按照序列，从C端到N端依次偶联，合成带侧链保护基的线性多肽树脂，再经脱除保护基、切 断树脂、HPLC纯化，得到第i和i+4或者i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换的ΡΤΗ(1-34)线 性多肽衍生物；所述的带保护的氨基酸单体选自于：Fmoc-Ser(tBu)-〇H，Fmoc-Val-〇H， Fmoc-Glu(OtBu)-〇H，Fmoc-Ile-〇H，Fmoc-Gln(Trt)-〇H，Fmoc-Leu-〇H，Fmoc-Met-〇H，Fmoc-His(Trt)-〇H,Fmoc-Asn(Trt)-〇H,Fmoc-Gly-〇H,Fmoc-Lys(Boc)-〇H,Fmoc-Arg(Pbf)-〇H, Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Phe-〇H;
[0043] 步骤(2)中，将步骤（1)中得到的第i和i+4或者i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替 换的ΡΤΗ(1-34)线性多肽衍生物置于反应容器中，加入适量水使其溶解，然后加入化学连接 臂，搅拌混匀。最后调节PH到9左右。如果浑浊，则加入适量乙腈或水使溶液澄清。盖玻璃塞， 室温搅拌反应l_2h，lh左右时使用HPLC监测反应。反应完全后使用制备型HPLC纯化，将制备 得到的液体冷冻干燥得ΡΤΗ(1-34)环化多肽衍生物。
【附图说明】
[0044] 图1是经样品多肽处理过的BM-MSCs的CFU-f和ALP阳性的面积图；
[0045]图2是样品肽的CD测试谱图；
[0046]图3所示的是样品多肽的半衰期。