用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产微生态菌剂领域，特别是涉及一种应用于水产养殖场现场发酵的 地衣芽孢杆菌制剂及应用方法。
【背景技术】
[0002] 随着水产养殖规模化、集约化及精养技术的发展，池塘中的残饵、排泄物及其它有 机污染物也日趋增多，有机污染物分解需要大量消耗溶氧，同时产生大量的有毒有害物质， 如氨氮，亚硝酸盐，硫化物等。随着这些有毒有害物质增加，不仅影响水产动物的生长、繁 殖，严重的甚至产生中毒死亡。而水体中病原微生物的数量与水体中氨氮、亚硝酸盐、硫化 物的浓度直接相关，如淡水鱼类细菌性败血症的发病条件之一是水体恶化，氨氮、亚硝酸盐 明显偏高。因此，如何有效地调控养殖水体的水质成为水产养殖业中一个关键问题。
[0003] 地衣芽孢杆菌因为具有稳定性好、抗性强、耐高温、耐酸碱，富产淀粉酶，蛋白酶， 抑制病原菌繁殖，促进动物营养的消化吸收，分解有机污染物，净化水质等优点而被广泛应 用于水产动物养殖中。
[0004] 为了能够利于生产，运输，我们生产产品中的芽孢菌主要是以孢子的状态存在，但 其应用于水体或水产养殖动物体内，都需要的主要是营养态细胞，因此，在水产上使用芽孢 杆菌制剂，在使用前会经过活化，即使芽孢状态的芽孢杆菌转化为营养态细胞，但传统上的 活化主要是加入一些红糖，或葡萄糖，培养基之类的营养物质促进其生长繁殖，如芽孢杆菌 制剂:红糖:水以1:1:10的比例进行"活化"，但传统上的"活化"存在以下几个方面的问题： 一是高营养培养基加水后易使空气与水中的酵母菌，乳酸菌繁殖迅速，消耗培养基中 营养，迅速降低培养液中PH，抑制芽孢的萌发与生长； 二是芽孢萌发前期需要时间长，一般需要4小时，芽孢才会开始萌发，而此时，由于"活 化"液中酵母菌与乳酸菌的大量繁殖导致PH下降迅速，已经可以抑制芽孢的萌发与繁殖，从 而大大影响芽孢萌发； 三是高营养培养基中也易感染大肠杆菌，真菌等有害杂菌，导致施用后效果差仍致有 反作用； 四是芽孢菌用量大，效果不稳定。
[0005] 然而到目前为止还没有公开过有关一种应用于水产养殖场现场发酵扩繁的能够 较好控制杂菌与促进地衣芽孢快速萌发的地衣芽孢杆菌制剂。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种应用于水产养殖场现场发酵扩繁的能 够较好控制杂菌与促进芽孢快速萌发的地衣芽孢杆菌菌剂及其应用方法，具体说是提供一 种可应用于水产养殖场现场发酵扩繁，利用纳他霉素抑制病原真菌，酵母菌等真菌与，利用 多粘杆菌素抑制大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌的生长，利用肌苷，果糖，丝氨酸等芽 孢萌发剂，能快速促进地衣芽孢的萌发，提高芽孢萌发效率，减少芽孢萌发时间，从而快速 使用地衣芽孢杆菌能在简易的发酵条件下，水与空气未经过灭菌的条件下，快速繁殖而占 据优势菌种，而更好的抑制其他的杂菌与有害菌，从而得到一种活菌含量高，活性好，杂菌 低的地衣芽孢杆菌发酵液。
[0007] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：用于水产养殖场现场发酵的地 衣芽孢杆菌制剂，制备该地衣芽孢杆菌制剂的原料为:地衣芽孢杆菌菌粉50-200份，硫酸粘 杆菌素5_50份，纳他霉素1_6份，肌苷20-100份，玉米粉50-200份，玉米衆粉50-200份，氯化 钠50-200份，丝氨酸20-100份，果糖20-50份，红糖50-200份。
[0008] 为了实现上述目的，用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂的制备方法包 括以下步骤： 0)、地衣芽孢杆菌菌粉的制备 取出地衣芽孢杆菌菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，30°C培养48小时。在 平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中30°C震荡培养24小时。种子采用 5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L的LB培养基，37°C震荡培养20-28小时，检测 其菌液浓度，活菌含量超过20亿CFU/ mL，即可作为地衣芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发 酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，每分钟通气量为液/气1:0.8，37°C培养16-24小 时，待芽孢含量不低于60亿CFU/ mL，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸 钙，调节菌浓度为100亿CFU/g，粉碎过100目即得到地衣芽孢杆菌菌粉。其中所述LB培养基： 蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1 OOOmL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%。其中，所述发 酵培养基:葡萄糖l〇g/L，玉米粉20 g/L，玉米浆粉10 g/L，豆柏粉20 g/L，硫酸镁0.5 g/L， 硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2。各培养基灭菌的条件为： 0 · 10-0 · 15MPa，121°C 灭菌 30 分钟； ③、混合，包装 将硫酸粘杆菌素5-50份，纳他霉素1-6份，肌苷20-100份，可溶性淀粉50-200份，干玉米 浆50-200份，氯化钠50-200份，丝氨酸20-100份，果糖20-50份，红糖50-200份，放置密封搅 拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤Φ制备的地衣芽孢杆菌菌粉50-200份加入搅拌 罐中搅拌均匀后，分装500克/包，真空包装，即得到用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆 菌制剂； 该地衣芽孢杆菌制剂用于水产养殖场现场发酵的应用包括以下步骤:一、将上述所制 备的地衣芽孢杆菌制剂与水的比例按1:10至1:30的比例搅拌均匀，调PH至8-8.2，前12小时 每分钟通气量液气比为1:0.5，12小时后通气量为1:0.8，培养24小时后即为现场发酵的地 衣芽孢杆菌的发酵液； 二，用于养殖池塘调水，将步骤一所制备的地衣芽孢杆菌发酵酵液以1:50至1:100的比 例稀释全池泼洒，其发酵液的用量为1-2L/亩； 三，用于调节养殖水产动物肠道，将步骤一制备的地衣芽孢杆菌发酵液以饲料的1%-2% 的量与饲料拌匀饲喂。
[0009] 其中，步骤一所述的水是井水，干净河水，放置一天以后的自来水等的一种。
[0010] 其中，步骤一所述的空气是未经过滤或灭菌的。
[0011] 其中，该地衣芽孢杆菌制剂中含有纳他霉素，纳他霉素是26种多烯大环内酯类抗 真菌抗生素的一种，主要由3种链霉菌产生，分别是恰努加链霉菌（St re ptomyces chattanovgensis)、纳塔尔链霉菌 Streptomyxes natalensis)和褐黄抱链霉菌 (Streptomyxes gilvosporeus)，经发酵、提取、精制获得的具有广谱、双效的生物防腐剂。 它既可以抑制各种霉菌、酵母的生长引起的食品腐败，又能抑制真菌毒素的产生，防止造成 毒素型食物中毒。1996年，我国批准纳他霉素用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及 易发霉的食品加工器皿的表面防腐。纳他霉素也被批准直接添加到发酵酒、酸奶和色拉酱 中，限量为l〇mg/kg。纳他霉素对人体无毒，而且无致突变、致癌、致畸和致敏作用，并且很难 被哺乳动物消化道吸收。给动物饲喂高剂量的纳他霉素，90%以上以原型及其分解产物随粪 便排出。研究表明，自然条件下，微生物很难产生对纳他霉素的抗性。纳他霉素的临床医学 应用范围也很广泛，可以用于抗皮肤、粘膜、阴道和肺部的真菌感染。纳他霉素是国际上唯 一获得批准的抗真菌生物防腐剂，是一种高效、安全的新型生物防腐剂。纳他霉素是一种多 烯烃大环内酯类抗真菌剂，多烯是一平面大环内酯环状结构，与细胞上留醇化合物相互作 用具有高度亲和性，由此引发细胞膜结构改变而破裂，导致细胞内容物的渗漏，使细胞死 亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些留醇化合物，所以纳他霉素对细 菌没有作用。
[0012]本发明中地衣芽孢杆菌制剂中含有硫酸粘杆菌素，粘杆菌素(Colistin)又名抗敌 素、多粘菌素 E<a950年，由日本小山康夫等从福岛县土壤中分离到一株多粘芽胞杆菌抗敌 素变株(Bacillus polymyxa var colistin)培养液中产生的一种锁环状多肽抗生素。它与 敏感菌胞浆膜中脂蛋白的游离磷酸盐相结合，使胞浆膜表面张力降低，通透性增加，导致胞 浆膜失去屏障作用而使细胞内嘌岭、嘧啶、核苷酸等外漏而死亡，属杀菌类抗生素。粘杆菌 素对大部分革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，如大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌等，但对革 兰氏阳性菌及真菌几乎无效。
[0013]本发明的地衣芽孢杆菌菌剂制剂以1:10-1:30的比例溶于水后，调PH至8-8.2，较 高的PH下，在扩繁发酵前期能较好的抑制乳酸菌的生长，一旦芽孢菌快速萌发繁殖后，就能 产生细菌素之类的抑制住乳酸菌的生长。
[0014] 本发明的地衣芽孢杆菌制剂中含有肌苷，丝氨酸，果糖等芽孢萌发剂，自然界中芽 孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为"萌发剂"，通常情况下，芽孢和促进 萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表 面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发 事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。本发明中的肌苷与丝氨酸是本发明人通 过一系列的单因素试验从20种萌发剂中筛选得到的对地衣芽孢有明显的提高其芽孢萌发 作用的萌发剂，两种萌发剂复配后能有效提高其芽孢萌发速度。
[0015] 本发明中含有大量的玉米粉，玉米浆，红糖，都是适合促进芽孢杆菌发酵繁殖的营 养剂，一旦芽孢萌发则会快速促进芽孢杆菌的繁殖与倍增。
[0016] 本发明采用上述方案的有益效果:地衣芽孢杆菌制剂与水按1:10-1:30的比例混 合