一种生物素化atps的储存试剂的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物素化ATPS的储存试剂。
【背景技术】
[0002] ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase，ATPS，EC 2.7.7.4)是一种可逆催化腺苷酰硫酸 (adenosine-5 ' -phospho sulfate，APS)与焦磷酸盐（pyrophosphate，PPi)反应生成三磷酸 腺苷(ATP)与硫酸盐的酶，在生物体硫代谢中发挥重要作用。ATPS广泛存在于植物、动物及 微生物中，但它在各种生物体当中的生物学作用略有不同。在植物和部分微生物中，是催化 硫酸盐同化反应第一步的关键酶。在ATPS的催化下，硫酸根离子与ATP反应，产生腺嘌呤-5' -磷酸硫酸APS和焦磷酸盐PPi。而在一些化学自养菌和化能无机营养菌中，ATPS是催化硫 化氢氧化生成无机硫酸盐最后一步的酶，其作用是催化APS和PPi反应生成ATP和硫酸根离 子，即上述反应的逆反应。ATPS已经从产黄青霉菌、鼠肝、卷心菜等生物体中提取并纯化得 到，而且编码ATPS的基因也已经从原核生物、真核生物、动物和植物中克隆出来并在适当的 宿主中得到表达。不同来源的ATPS结构不同，大肠杆菌来源的ATPS是异源二聚体且需要GTP 激活，酵母、真菌以及植物来源的ATPS是单体或是同源寡聚体。在分子生物学方面，目前已 通过氨基酸修饰等手段研究其结构和功能的关系，加深了对ATPS作用机制的了解。偶连ATP 硫酸化酶可以应用于很多方面，如:PPi定量、RNA测定、DNA测序、DNA聚合酶酶活测定等，其 中ATPS在焦磷酸测序技术发挥重要作用。
[0003] 焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是利用DNA聚合酶(polymerase )、ATPS、焚光素 酶（lucif erase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)四种酶催化的同一反应体系中的酶级联 化学发光反应进行DNA测序的技术，其实质是利用生物发光反应进行序列测定的技术。焦磷 酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和上述4种酶构成，反应底物为5'-腺苷酰硫酸(adenosine-5'-phosphosulfat，APS)和焚光素（luciferin)。在每一轮测序反 应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱 基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其掺入到测序引物链的3'末端，同时释放出一分子 的PPi;在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成等量的ATP;生成的ATP在荧 光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，通过微弱光检测装 置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加 入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应 体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。待上一轮反应完成后， 加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 [0004]近年来出现了一种高通量光导纤维皮升级微反应池阵列焦测序技术，该技术一次 可以测定上百万个样品，其出现带来了测序技术的革命，这极大地推动了后基因组计划的 发展。这种高通量焦磷酸测序技术需要对ATPS进行生物素化修饰，使之便于固定在微球表 面。众所周知，酶活会直接关系到测序反应的准确度，而酶储存试剂的优劣又直接影响到酶 活。ATPS作为一种生物活性蛋白，在储存、运输和销售过程中易失活，目前常用的酶储存试 剂并不能有效保护生物素化ATPS的酶活，也没有一种专门针对生物素化ATPS的储存试剂。 因此，开发一种专门针对生物素化ATPS的储存试剂，保证其在储存、运输和销售过程中的稳 定性，是该酶工业化生产的应用基础。
【发明内容】
[0005] 本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技 术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0006] 本发明中涉及的英文符号：
[0007] Tris-HCl指利用三羟甲基氨基甲烷(Tris)和盐酸配制的缓冲液;EDTA指乙二胺四 乙酸;DTT指二硫苏糖醇;Tris-Ac指利用三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制的缓冲液;BSA指牛 血清白蛋白；PVP指聚乙烯吡咯烷酮。
[0008] 本发明要解决的一个问题是提供一种生物素化ATPS的储存试剂，该储存试剂包括 以下组分:Tris-HCl、氯化钠、EDTA和DTT，溶剂为去离子水。
[0009] 上述储存试剂中，Tris-HCl的浓度为25~50mM;优选为30~40mM;进一步优选为32 ~36mM〇
[0010] 上述储存试剂中，Tris-HCl的pH值为7.0~8.0;优选为7.2~7.8;进一步优选为 7.4~7.6〇
[0011] 上述储存试剂中，氯化钠的浓度为10~35mM;优选为10~30mM;进一步优选为15~ 25mM〇
[0012] 上述储存试剂中，EDTA的浓度为0.02~0.08mM;优选为0.03~0.07mM;进一步优选 为0.04~0.07mM。
[0013] 上述储存试剂中，DTT的浓度为0.02~0.08mM;优选为0.04~0.07mM;进一步优选 为0·04~0·06mM。
[0014] 在某些优选的实施方案中，所述的生物素化ATPS的储存试剂中还包括:蔗糖、山梨 醇和硫代硫酸钠中的一种或多种。
[0015] 所述的蔗糖的浓度为30~lOOrnM;优选为40~90mM;进一步优选为50~80mM;再一 步优选为60~70mM。
[0016] 所述的山梨醇的浓度为10~20mM;优选为12~18mM;进一步优选为14~16mM。
[0017] 所述的硫代硫酸钠的浓度为〇 · 4~0 · 8mM;优选为0 · 4~0 · 7mM;进一步优选为0 · 5~ 0.6mM〇
[0018] 本发明要解决的另一个问题是提供上述生物素化ATPS的储存试剂的使用方法:使 用时，先将生物素化ATPS与甘油按照1: 2的体积比混匀，得到生物素化ATPS的甘油溶液;再 将该生物素化ATPS的甘油溶液与本发明所述的ATPS储存试剂按照3:1的体积比混合均匀。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 本发明提供的生物素化ATPS储存试剂，对生物素化ATPS的活性有保护作用，是的 生物素化ATPS在-80°C、_20°C和4°C下放置1个月，活性几乎不变;在_80°C、_20°C和4°C下放 置3个月，分别能够维持>99%、>97%以及>92%的残余活力；在-80°(3、-20°(3和4°(3下放置6 个月，分别能够维持>97%、>93%以及>90%的残余活力；在25°(3、30°(3和35°(3下放置1211，能 够维持>97 %的残余活力;在25°C、30°C和35°C下放置24h，能够维持>95 %的残余活力；在25 °C、30°C和35°C下放置48h，能够维持>93 %的残余活力。本发明提供的生物素化ATPS储存试 剂在以上各个储存条件下对ATPS的活性保护均优于常规50%甘油的储存条件。
[0021] 加入本发明提供的储存试剂后，生物素化ATPS在冻融1次和3次后，均能够维持〉 93 %的残余活力;在冻融5次后，均能够维持>97 %的残余活力;在冻融10次后，均能够维持〉 94 %的残余活力。而在50 %甘油中，生物素化ATPS在反复冻融10次后，仅剩13.1 %的残余活 力;不加任何试剂的生物素化ATPS在反复冻融10次后，仅剩5.8 %的残余活力。
[0022] 综上所述，本发明提供的储存试剂能够延长生物素化ATPS的储存时间，减少反复 冻融对其活性的影响；并且使得生物素化ATPS可以长期存放于-80°C、_20°C和4°C下，增加 了其储存温度的选择性;还能够有效降低ATPS上生物素标签的脱落率。
【具体实施方式】
[0023] 如无特殊说明，本发明涉及的化学或生物试剂均购自Sigma-Aldrich公司；生物发 光检测仪购自Promega公司，型号为GloMax20/20。
[0024] 实施例1 一种生物素化ATPS的储存试剂
[0025] 包括以下组分：Tris-HCl 25mM ρΗ7·0、氯化钠 10mM、EDTA0.02mM和DTT0.02mM，溶 剂为去离子水。
[0026] 实施例2-种生物素化ATPS的储存试剂
[0027] 包括以下组分：Tris-HCl 30mM ρΗ7·2、氯化钠 15mM、EDTA0.03mM和DTT0.03mM，溶 剂为去离子水。
[0028]实施例3-种生物素化ATPS的储存试剂
[0029] 包括以下组分：Tris-HCl 35mM ρΗ7·4、氯化钠20mM、EDTA0.04mM和DTT0.04mM，溶 剂为去离子水。
[0030] 实施例4 一种生物素化ATPS的储存试剂
[0031 ]包括以下组分：Tris-HCl 40mM ρΗ7·6、氯化钠25mM、EDTA0.05mM和DTT0.06mM，溶 剂为去离子水。
[0032]实施例5-种生物素化ATPS的储存试剂
[0033]包括以下组分:Tris-HC145mM ρΗ7·8、氯化钠30mM、EDTA0.06mM和DTT0.06mM，溶剂 为去离子水。
[0034]实施例6-种生物素化ATPS的储存试剂
[0035] 包括以下组分：Tris-HC150mM pH7.8、氯化钠35mM、EDTA0.07mM和DTT0.07mM，溶剂 为去离子水。
[0036] 实施例7-种生物素化ATPS的储存试剂
[0037] 包括以下组分：Tris-HC150mM pH8·0、氯化钠35mM、EDTA0·08mM和DTTO.08mM，溶剂 为去离子水。
[0038] 实施例8-种生物素化ATPS的储存试剂