一种多酶体系的定向共固定化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多酶体系的定向共固定化方法，属于蛋白质固定化领域。
【背景技术】
[0002]细胞中的许多酶常常是在一个连续的反应链中起作用，连续链反应是指前一个酶反应的产物是后一个酶反应的底物。在完整的细胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的反应链体系统称多酶体系。多酶体系亦称多酶复合体，多酶体系，多酶系统，多酶簇。连续反应体系中前一反应的产物为后一反应的底物，反应依次连接，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。由于这一序列反应是在一高度有序的多酶复合体内进行，从而提高了酶的催化效率，同时利于对酶的调控。在完整细胞内的许多多酶体系都具有自我调节能力。
[0003]将具有生物活性的黄素酶与过氧化物酶定向共固定化，可以充分利用黄素酶与过氧化物酶的协同效应，在生物传感器等领域有着重要的应用价值。但是，传统的酶固定化方法所获得的固定化酶结构，酶是在任意位点和载体相连接，这种方法主要不足之处在于常常导致固定化酶的活性出现大幅度下降。而黄素酶与过氧化物酶定向共固定化，是利用酶辅基与酶的亲和作用，将黄素酶与过氧化物酶以有序的方向在载体特定的位点连接起来，天然构象基本保持不变，这有助于高效实现这一多酶体系的生物功能，具有更重要的研究与应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的课题在于提供了一种多酶体系的定向共固定化方法，目的是克服传统单酶固定化方法的种种不足，实现多酶体系的定向固定化的条件优化。
[0005]为了解决上述课题，本发明采用如下技术:
[0006]—种多酶体系的定向共固定化方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007]步骤一，利用带环氧键或羧基的载体材料上的功能基团，与3，5_二氨基苯甲酸(3，5-DABA)的一个氨基进行反应，将3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)的共价键接到载体材料上，获得接有3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)的载体材料，以S_( 3，5-DABA)表示;其中3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)与载体材料的质量比为1-5:2;
[0008]步骤二，将步骤一得到的S-(3，5-DABA)与聚苯胺(PANI)反应，反应通过S_(3，5-DABA)上氨基苯甲酸的氨基与聚苯胺反应，形成共价键，聚苯胺和S-(3，5-DABA)的质量比为1-5:10，获得接有聚苯胺的载体材料，以S-(3，5-DABA)-PANI表示；
[0009]步骤三，将黄素酶的辅基黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)上的氨基，与步骤二所得S-(3，5-DABA)-PANI进行反应，通过S-(3，5-DABA)-PANI上苯甲酸的羧基与黄素腺嘌呤二核苷酸的氨基反应，形成共价键，载体材料与黄素腺嘌呤二核苷酸的质量比为1-5:2，经酰胺键连接，获得接有黄素腺嘌呤二核苷酸的载体，以S-( 3，5-DABA) -PAN1-FAD表示；
[0010]步骤四，氧化物酶的辅基(活性中心)一氯化血红素(Hemin)上的羧基，与步骤三所得 S- (3，5-DABA) -PAN1-FAD 进行反应，通过 S- (3，5-DABA) -PAN1-FAD 上的聚苯胺(PANI)的氨基进行反应，形成共价键，所得产物以S-(3，5-DABA)-PAN1-FAD-Hemin表示；用还原剂对产物进行还原处理，还原剂与产物的质量比为8000-500: 5 ;其中，氯化血红素与S-( 3，5-DABA)-PAN1-FAD的质量比为1:卜5。
[0011]步骤五，将脱辅基的黄素酶、脱辅基的过氧化物酶与步骤四中S-(3，5-DABA)_PAN1-FAD进行亲和吸附，脱辅基的脱辅基的黄素酶、脱辅基的过氧化物酶与载体的质量比为1: 1:1-5，获得定向共固定化的多酶体系。在本发明中，脱辅基的黄素酶、脱辅基的过氧化物酶都可以通过正常的外购行为所得；
[0012 ]作为优选，上述一种多酶体系的定向共固定化方法中的步骤一中所述的载体材料为氧化石墨烯、石墨烯、碳纳米管、或石墨中的至少一种。
[0013]作为优选，上述一种多酶体系的定向共固定化方法中的步骤三中所述的黄素酶为葡萄糖氧化酶(GOx)、胆固醇氧化酶、琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶、或脂酰CoA脱氢酶中的至少一种。
[0014]作为优选，上述一种多酶体系的定向共固定化方法中的步骤四中所述的过氧化物酶为细胞色素、过氧化氢酶、或过氧化物酶中的至少一种。
[0015]作为优选，上述一种多酶体系的定向共固定化方法中的步骤五中所述的还原剂为水合肼、硼氢化钠、或柠檬酸钠中的至少一种。。
[0016]有益效果:本发明同现有技术相比具有以下优点及效果:采用将多酶体系定向共固定化，可以高效实现多酶体系的生物活性。
【附图说明】
[0017]图1共酶体系加入GOD:HRP=1:1 (lmg/ml);底物为50mM葡萄糖溶液，循环伏安法((^)检测范围为0?0.8￥，？六见(1):]\^ = 5400，]\111 = 4000检测的结果
[0018]图2共酶体系加入GOD:HRP = 1:1 (lmg/ml);底物为50mM葡萄糖溶液。循环伏安法(CV)检测范围为O?0.8V，PANI(氯仿):Mw = 6300，Mn = 4100检测的结果
[0019]图3不同enzyme固定法电化学活性对比
[0020]2R G0-3，5-PANI(2)-FAD apo-GOD+HRP GOD咬合，HRP吸附
[0021]3R G0-3，5-PANI(2)G0D+HRP双酶吸附
[0022]4R GO-3,5-PANI(2)-FAD-Hemin apo-GOD+apo-HRP G0D、HRP均咬合
[0023]5R G0-3,5-PANI(2)-Hemin GOD+apo-HRP HRP咬合，GOD吸附
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
[0025]实施例1
[0026]实验步骤:
[0027]1.氧化石墨烯(G0)_3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)
[0028]称取氧化石墨稀1.0g，置于烧杯内，加入200ml THF，超声2h;再加入1.0g3，5-二氨基苯甲酸(?6.57 X 10—3mol)，继续超声30min ；将超声后的溶液转移至三口烧瓶中，封闭反应瓶，抽真空，充氮气，加热至70°C冷凝回流，磁力搅拌2h;反应溶液离心，并用无水乙醇洗涤沉淀数次;沉淀物置于真空烘箱中干燥。
[0029]2.G0-3，5-DABA-聚苯胺(PANI)
[0030]称取G0-3，5-二氨基苯甲酸0.3009g，加入60ml匪P混合，超声分散；加入聚苯胺0.1509g，搅拌均匀；将0.071 Og过硫酸铵(?3.11 X 10-4mol)用1ml 1.0M盐酸溶液溶解，缓慢滴加入反应瓶;滴加完成后，继续搅拌反应2h;将反应溶液离心(5000rpm，5min)洗涤数次，沉淀置于真空烘箱中干燥。
[0031 ] 3.G0-3，5-DABA-PAN1-黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)
[0032]称取G0-3，5-DABA-PANI20mg，用20ml pH = 5.27PBS缓冲液溶解，加入0.1156gNHS( I.0mM)和0.2867g EDC( I.5mM)，搅拌30min ；离心(1000rpm，5min)，洗去未反应的EDC和NHS ；所得活化产物用pH = 7.4的PBS缓冲液稀释至5ml，超声5min ；称取1mg FAD加入，搅拌过夜;离心洗涤，真空干燥。
[0033]4.G0-3，5-DABA-PAN1-FAD-氯化血红素(Hemin)
[0034]将G0-3，5-DABA-PAN1-FAD取1mg，用pH= 5.27PBS缓冲液溶解稀释至1ml ；加入
0.0577g NHS(0.5mM)和0.1435g EDC(0.75mM)，搅拌30min;称取5mg Hemin加入，搅拌过夜;
离心洗涤，并真空干燥。
[0035]5.还原 G0-3，5-DABA-PAN1-FAD-Hemin
[0036]取5mgGO-3,5-DABA-PAN1-FAD-Hemin以pH = 7.4PBS缓冲液溶解至5ml，量取20ml80 %水合肼加入，搅拌反应4h;离心洗涤除去水合肼，真空干燥待用。
[0037]6.双酶反应体系的构建一葡萄糖氧化酶(GOD)+辣根过氧化物酶(HRP)
[0038]取已还原GO-3,5-DABA-PAN1-FAD-Heminlmg，溶解于Iml pH = 7.4PBS缓冲液，分别取Iml lmg/ml去辅基的GOD(apo-GOD)和Iml lmg/ml去辅基的HRP(apo-HRP)加入，搅拌反应30min，存放于4°C条件下待用。
[0039]活性测试:
[0040]1.GOD-HRP双酶体系与GOD单酶体系活性对比[0041 ] 1.1PANI (I): Mw = 5400，Mn = 4000
[0042]共酶体系加入G0D:HRP = 1: l(lmg/ml);底物为50mM葡萄糖溶液。循环伏安法(CV)检测范围为O?0.8V，初步测定活性最佳提高4.24倍，如图1所示，
[0043]1.2PANI(氯仿):Mw = 6300，Mn = 4100
[0044]共酶体系加入G0D:HRP = 1: l(lmg/ml);底物为50mM葡萄糖溶液。循环伏安法(CV)检测范围为O?0.8V，初步测定活性最佳提高3.62，如图2所示。
[0045 ] 2.不同enzyme固定法电化学活性对比
[0046]所测