率分布
[0037] 1. 8. 2PID1基因不同基因型与肉质品质关系 根据所检测群体的数据结构，利用SPSS18. 0统计软件包的最小二乘分析方法对所发 现的突变位点与肉质品质之间的关系进行了统计分析。结果显示：PID1基因第2外显子 第195位T※C转换的突变对布莱凯特黑牛的肌内脂肪含量、TG含量未产生显著影响（P > 0. 05) ;PDSS2、C0Q2、C0Q3基因中的突变对布莱凯特黑牛的肌内脂肪含量、TG含量也未产生 显著影响；但PID1基因第2外显子第285位T※G转换的突变对布莱凯特黑牛的肌内脂肪 含量、TG含量有显著影响（P < 0. 05)。 表2-1布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子不同基因型与肌内脂肪含量的分析 注：同行、列数据不同字母间差异显著（P< 0.05)，相同字母差异不显著（P>0. 05) 表2-2布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子不同基因型与肌内脂肪含量的分析 注：同行、列数据不同字母间差异显著（P< 0.05)，相同字母差异不显著（P>0. 05) 表3-1布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子不同基因型与组织中TG含量的分析 注：同行、列数据不同字母间差异显著（P< 0.05)，相同字母差异不显著（P>0. 05) 表3-2布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子不同基因型与组织中TG含量的分析 注：同行、列数据不同字母间差异显著（P< 0.05)，相同字母差异不显著（P>0. 05) 表4-1布莱凯特黑牛TOSS2基因不同基因型与肌内脂肪含量的分析 注：同行、列数据不同字母间差异显著（P< 0.05)，相同字母差异不显著（P>0. 05) 表5-1布莱凯特黑牛COQ2基因不同基因型与肌内脂肪含量的分析 注：同行、列数据不同字母间差异显著（P< 0.05)，相同字母差异不显著（P>0. 05) 表6-1布莱凯特黑牛COQ3基因不同基因型与肌内脂肪含量的分析 注：同行、列数据不同字母间差异显著（P< 0.05)，相同字母差异不显著（P>0. 05) 1. 8. 3结论： 通过对各种基因突变的研究分析，仅PID1基因第2外显子第285位发生的T※G转换 突变对布莱凯特黑牛的肌内脂肪含量、TG含量有显著影响（P < 0. 05)，彼此有明显的对应 关系，因此确定了通过对该突变的检测来筛选优质牛种的方法。
[0038] 实施例2 PCR-RFLP法筛选优质牛种，步骤如下： 1、 按上述实施例1的方法取布莱凯特黑牛的耳组织，用天根生化科技（北京）有限公 司的组织基因组DNA提取试剂盒提取布莱凯特黑牛基因组DNA，作为PCR扩增的模板DNA ; 2、 采用PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子，得PCR产物，扩增所用的引物如 下： 上游引物：5' GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3' 下游引物：5' TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3' ； PCR 反应体系和条件如下：模板 DNA (50ng/ μ L) 2· Ο μ L，10 X buf f er (Mg2+) 5· Ο μ L， (1犯13(2111111〇1/1)4.(^1^，上下游引物（1(^111〇1/2 4 1^)各1.(^1^，丁&9酶（51]/^1^)0.3 4 1^，加 双蒸水至总体积为50. Ο μ L。PCR反应条件为：94°C预变性7min，然后进入94°C变性30s、 56°(：退火3〇8和72°(：延伸458,30个循环，最后72°(：延伸1〇1^11。取5以1^产物，1.0%琼脂 糖凝胶电泳检测。 3、采用天根生化科技（北京）有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产 物的纯化回收，利用限制性内切酶Asel消化酶切纯化的PCR产物，再对酶切后的片段用浓 度2%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定PID1基因第2外显子第285 位的碱基多态性。 酶切体系如下： 将酶切体系各组分混匀，于37°C金属浴中反应2h。
[0039] 上述方法用浓度为2%的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，可以检 测出PID1基因第2外显子第285位T/G变异位点。当布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子 的基因型为AA基因型即T285T纯合子时，序列为ATTAAT，此位点能被Asel内切酶识别，经 内切酶消化后的PCR产物会产生2个片段；BB基因型为G285G纯合子，不会产生Asel内切 酶酶切位点，经Asel内切酶消化后的PCR产物仍为1个片段；AB基因型为T285G杂合子，经 Asel内切酶消化后的PCR产物会产生3个片段。因此在实际应用中，可以通过酶切片段的 个数判断285位基因型，从而能简单的判断出我们所需要的G285G纯合子优质基因型。即 选择内切酶消化后的PCR产物仍为1个片段的布莱凯特黑牛为优质牛种。
[0040] PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切 割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同， 产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且 方法简便，分型时间短。与现有技术相比，本发明把测序技术筛选SNP和PCR-RFLP技术结 合起来，解决了 SSCP的不稳定性和普通RFLP的局限性，提供了一种用简单、快速、低成本、 精确度高的、便于推广的DNA水平筛查和检测与布莱凯特黑牛生产性状密切相关的遗传标 记，可用于布莱凯特黑牛的分子育种。
【主权项】
1. 一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，其特征是：PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基 因第2外显子的基因序列，选择PID1基因第2外显子的第285位碱基为G的布莱凯特黑 牛为优质牛种。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是包括以下步骤： (1) 取布莱凯特黑牛待检样本，提取DNA，作为PCR扩增的模板DNA; (2) 采用PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子，得PCR产物，扩增所用的引物如 下： 上游引物：5'GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3' 下游引物：5'TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3' ； (3) 利用限制性内切酶酶切扩增的PCR产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳 检测，选择琼脂糖凝胶电泳产生1个片段的布莱凯特黑牛为优质牛种。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：PCR反应条件为：94°C预变性7min、 94°C变性30s、56°C退火30s、72°c延伸45s，30个循环，最后72°C延伸lOmin。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：PCR反应体系为：模板DNA2. 0μL，含Mg2+的10XPCRBuffer5. 0yL，dNTP4. 0yL，扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子 的上、下游引物各1.0yL，5U/yL的Taq酶0.3yL，加双蒸水至总体积为50.0yL。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征是：所述限制性内切酶为限制性内切酶AseI。6. 根据权利要求2或5所述的方法，其特征是：用限制性内切酶进行酶切时，酶切体系 如下：10U/yL的限制性内切酶0.5yL，10XNEBuffer3.12yL，PCR产物10yL，加双 蒸水至总体积为20. 0μL。7. -种扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的引物，其特征是： 上游引物：5'GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3' 下游引物：5'TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3'。8. -种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的试剂盒，其特征是：包括单独包装的权利要求7 所述的扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的引物，以及限制性内切酶AseI。9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征是：还包括单独包装的含Mg2+的10XPCR Buffer、dNTP、Taq酶和lOXNEBuffer3. 1〇10. 根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征是，包括以下成分，各成分均单独包装： 扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的上游引物：1. 0μL; 扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的下游引物：1. 0μL; 含Mg2+的 10XPCRBuffer:5.0yL; dNTP：4. 0μL； 5U/μL的Taq酶：0· 3μL; 10U/yL的限制性内切酶AseI:0. 5yL; lOXNEBuffer3· 1 :2μL。
【专利摘要】本发明公开了一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，包括：PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的基因序列，选择PID1基因第2外显子第285位碱基为G的布莱凯特黑牛为优质牛种。本发明还公开了筛选所需的引物和试剂盒。本发明首次提出以检测PID1基因突变碱基来筛选优质牛种的方法，为培育优质布莱凯特肉牛品种提供了新的思路。本发明优选使用PCR-RFLP方法来检测布莱凯特黑牛碱基突变和基因型，通过电泳片段的个数即可筛选出优质牛种，把测序技术筛选SNP和PCR-RFLP技术结合起来，解决了SSCP的不稳定性和普通RFLP的局限性，简单、快速、成本低、精确度高、检测结果直观、便于推广。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105441434
【申请号】CN201510241911
【发明人】董雅娟, 钟世勋, 董懿为
【申请人】董雅娟
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年5月13日