一种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 也称为凋亡素-2 配体 (Apo_2L) ，是新近发现的肿瘤坏死因子 (TNF)基因超家族成员，属于II型跨膜蛋白（transmembrane protein)。TRAIL是一个由281 个氨基酸构成的II型跨膜蛋白，其中从第114个精氨酸（arginine)到第281个甘氨酸 (glysine)的序列为诱导癌细胞凋亡的主要功能区域。它能通过与死亡受体结合选择性诱 导多种肿瘤细胞与转化细胞发生凋亡，而对正常组织和细胞几乎没有不良反应。这一特性 使得TRAIL在肿瘤的靶向治疗中具有良好的应用前景，被认为是一种非常具有发展潜力的 抗肿瘤因子，近年已成为国内外研究的热点。但单体结构的TRAIL不能诱导细胞凋亡，把 TRAIL应用到临床上仍有许多问题亟待解决。为了实现TRAIL诱导细胞凋亡的目的，现有技 术中通过重组TRAIL形成二聚体或多聚体后与死亡受体(DR4，DR5)相结合发挥细胞凋亡的 作用，但现有技术中针对重组TRAIL的制备方法存在生物活性低、产量低、性质不稳定、易变 性等缺点。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的之一是为解决重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体生物活性低、产 量低、性质不稳定、易变性的难题，提供一种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方 法，利用PET表达载体对人类TRAIL基因（114-281序列）进行基因克隆制作出具有N-末端组 氨酸标签(Histidine tag)和异亮氨酸拉链基序（Leucine zipper)的TRAIL重组基因 (PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281，简称HZ-TRAIL)。本发明的制备的重组肿瘤坏死因子相 关凋亡诱导配体对抗肿瘤和抗类风湿关节炎具有高药效的优点。为了达到上述技术效果， 本发明技术方案包括:一种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方法，所述制备方 法包括以下步骤：
[0004] 步骤一 :HZ-TRAIL的制备:利用PET表达载体对人类TRAIL蛋白中114-281基因序列 进行基因克隆，制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因 PET23dw-His-ILZ-h TRAILm-281 的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL;
[0005] 步骤二:HZ-TRAIL的提取和纯化:将步骤一制备出的HZ-TRAIL转化到大肠杆菌中， 并在含有lmmol/L异丙基硫代半乳糖苷的LB培养液中进行扩繁处理，然后将HZ-TRAIL在大 肠杆菌中重组表达，大肠杆菌细胞通过声波降解法裂解，并离心处理后，取20ml上清液缓慢 注入到镍-氮三乙酸螯合琼脂糖柱中，使HZ-TRAIL中的组氨酸和金属镍离子充分吸附，利用 镍-亲和色谱法进行逐步洗脱提取HZ-TRAIL，再经凝胶过滤层析法进行纯化，保存在-20°C。
[0006] 所述步骤二中的扩繁处理条件为在25~30°C，扩繁6~9个小时。
[0007] 所述步骤二中的离心处理条件为调节转速为12000rpm，温度为4°C，离心处理 20min〇
[0008] 所述的重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0009] 所述的重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白适用于在大肠杆菌、酵母和哺乳 动物细胞中表达。
[0010] 所述的重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白可诱导癌细胞或炎性淋巴细胞 凋亡。
[0011] 所述的重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白可应用于抗肿瘤药物中。所述的 重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白可应用于类风湿性关节炎药物中。
[0012] 本发明的有益效果包括：
[0013] 1、本发明的一种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方法可成功制备HZ-TRAIL，且产物活性高、产量高、性能稳定、不易变形。
[0014] 2、本发明的一种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方法所制备出的HZ-TRAIL可以诱导多种癌细胞的凋亡，而对正常组织和细胞无任何副作用。
[0015] 3、本发明的一种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方法所制备出的HZ-TRAIL在RA发病过程中通过诱导炎性淋巴细胞的凋亡，降低炎症反应，对关节起保护作用。
【附图说明】
[0016] 图1所示为本发明一种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方法的模式 图。
[0017] 图2所示为本发明野生型TRAIL和实施例2制备出的HZ-TRAIL的SDS-PAGE比较图。 [0018]图3所示为本发明制备出的HZ-TRAIL对大肠癌细胞(HCT116)杀伤能力图。
[0019] 图4A所示为本发明HZ-TRAIL对子宫癌细胞(HeLa)凋亡和细胞坏死比例柱状图； [0020]图4B所示为本发明HZ-TRAIL对子宫癌细胞(HeLa)形态及颜色变化图。
[0021]图5所示为本发明实施例7建立类风湿关节炎动物模型和处理药物流程图。
[0022]图6A所示为本发明实施例7HZ-TRAIL对类风湿关节炎模式小鼠（CIA)治疗的浓度 依赖性发病率变化图；
[0023]图6B所示为本发明实施例7HZ-TRAIL对类风湿关节炎模式小鼠（CIA)治疗的浓度 依赖性关节炎临床指数的变化图。
[0024]图7A所示为本发明实施例7野生型小鼠（对照组)关节组织病理图；
[0025]图7B所示为本发明实施例7处理PBS后小鼠（阳性对照组)关节组织病理图；
[0026] 图7C所示为本发明实施例7处理30yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠关节组织病理图； [0027] 图7D所示为本发明实施例7处理150yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠关节组织病理图； [0028] 图7E所示为本发明实施例7处理300yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠关节组织病理图。 [0029]图8A所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介质TNF-a 水平的变化图；
[0030]图8B所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介质IL-Ιβ 水平的变化图；
[0031 ]图8C所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介质IFN-γ 水平的变化图；
[0032]图8D所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介质IL-2水 平的变化图。
[0033]图9A所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中免疫球蛋白IgGl 的水平的变化图；
[0034]图9B所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中免疫球蛋白 IgG2a的水平的变化图。
[0035]图10A所示为本发明实施例8HZ-TRAIL抑制炎性淋巴细胞的增殖效果图；
[0036]图10B所示为本发明实施例8HZ-TRAIL对促炎介质IL-2的表达水平变化图；
[0037]图10C所示为本发明实施例8HZ-TRAIL对促炎介质IFN- γ的表达水平变化图。
[0038]图11Α所示为本发明实施例8HZ-TRAIL抑制Jurkat细胞的增殖效果图；
[0039]图11B所示为本发明实施例8HZ-TRAIL诱导炎性T淋巴细胞凋亡能力图；
[0040]图11C所示为本发明实施例8HZ-TRAIL对凋亡关联caspase 3蛋白质的水平变化 图。
【具体实施方式】
[0041] 下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中 描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达 到更好的技术效果。
[0042] 实施例1
[0043] -种重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方法，本发明一种重组肿瘤坏死 因子相关凋亡诱导配体的制备方法的模式图，包括以下步骤：
[0044] 步骤一 :HZ-TRAIL的制备:利用PET表达载体对人类TRAIL蛋白中114-281基因序列 进行基因克隆，制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因 PET23dw-His-ILZ-h TRAIL114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL，如图1所示HZ-TRAIL的制备模式图； [0045]步骤二:HZ-TRAIL的提取和纯化:将步骤一制备出的HZ-TRAIL转化到大肠杆菌中， 并在含有lmmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培养液在25°C，扩