一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及检测细胞自噬现象的基因载体的构建，并利 用所述基因定位表达载体研究细胞自噬现象。
【背景技术】
[0002]自(Autophagy)是细胞内一项重要的降解机制，通过自·可将细胞内衰老蛋白 质运送至溶酶体进行降解。细胞自噬现象广泛存在于大多数真核生物包括酵母、果蝇、植物 及人体的细胞中，是细胞循环利用自身已损坏蛋白质、细胞器中所包含的氨基酸等营养物 质的一种重要方式，也是真核生物进化过程中形成的一种对环境的适应。
[0003] 细胞自噬的过程可大致分为四个阶段:一，细胞接收到如饥饿、营养因子缺乏或病 虫害侵袭等自噬诱导信号后，胞浆中产生一定量的扁平游离双层磷脂膜结构，围绕在待降 解物周围；二，膜结构不断延伸，将胞浆、细胞器等待降解物包绕起来，形成封闭的自噬体； 三，自噬体通过细胞骨架微管网络系统运输至溶酶体内并与之融合形成自噬溶酶体；四，形 成自噬溶酶体后，自噬体的膜结构被降解，降解产物被运输至胞浆中待重新利用，残渣被滞 留在胞浆中或被转运出细胞。近年来的研究表明在植物病虫害感染过程中，自噬发挥了很 大恶作用，即使没有任何异常蛋白的存在，失去自噬作用就可以导致疾病的发生。一些自噬 相关基因 (Autophagy related gene，Atg)的表达对自调控的成熟有重要作用，在自体 形成的不同阶段，不同的Atg对其进行不同的调控。
[0004] Atg8在酵母、拟南芥中是极其保守的。有实验表明，在真核生物中，Atg5-Atgl2编 码的蛋白复合体参与了自噬体的形成;Atg8-磷脂酰乙醇胺复合体控制了自噬体的膨胀。已 有关于酵母和哺乳动物的研究表明Atg8及其同源基因可以明确地定位自噬体并因此成为 自噬现象的标记基因。在植物中，也不乏有关Atg8基因的研究。Su等从水稻中克隆了 OsAtgS，并通过实验证明了Atg8的接合通路功能在水稻中是保守的，因此推断该基因很可 能在水稻自噬系统中发挥了重要作用。可以肯定的是，Atg8基因在自噬过程中发挥了重要 的作用，但要明确Atg8参与自噬的形成的一系列分子机理，目前仍缺少相关的鉴定和检测 材料。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种检测真核生物细胞自噬现象和自噬小体的基因定位表达载体，所 述基因载体包含一个在烟草中发现的有关自噬现象、参与自噬体形成的保守同源基因 NtAtg8和一个标记荧光蛋白的基因 GFP作为报告基因。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，以红花大金元烟草品种 为材料，提取RNA，反转录得cDNA，以NtAtg8-F/NtAtg8-R为引物对，进行PCR扩增NtAtg8基 因，双酶切体系处理DNA片段并回收，采用同样的双酶切体系处理pFF19-GFP质粒并回收;将 含有同样粘性末端的NtAtg8基因和pFF19-GFP载体进行连接，连接产物转化到DH5a感受态 细胞中，挑选阳性菌落测序验证。
[0008] 所述NtAtg8基因和PFF19-GFP载体连接的体系为:酶切后质粒各ΙμL、Buffer ΙμL、 T4连接酶ΙμL，补水至?ομL，16°C连接过夜。
[0009] 所述NtAtg8-F/NtAtg8-R引物对序列如SEQ ID N0:1/SEQ ID N0:2所示，其中 GGTACC为Κρη頂每切位点，GGATCC为Banffl酶切位点。
[0010] 所述NtAtg8基因的片段如SEQ ID N0:3所示。
[0011] 所述NtAtgS基因翻译的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0012] 所述PCR扩增的反应条件如下：94°C预变性5min，94°C30s，62°C30s，72°C40s，35个 循环，再 72°C10min，16°C10min，4°C^：^#。
[0013] 所述双酶切体系为：BufferK 2.5yL，BamHI 2.5yL，SphI 2.5yL，模板20yL，加灭菌 水至50yL。
[0014] 一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体的应用，将NtAtg8-pFF19-GFP质粒转 入烟草悬浮细胞，通过激光共聚焦显微镜观察悬浮细胞，定位自噬体。
[0015] 所述将质粒转入烟草悬浮细胞的方法为基因枪介导转化法。
[0016] 所述基因定位表达载体在分析植物细胞自噬分子机理的应用。
[0017] 本发明的有益效果在于:利用本发明构建的载体，使其蛋白与目的基因标记的蛋 白融合后在悬浮细胞中表达，通过激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的位置而进行的亚细胞 定位，是一种简便而又准确的在活细胞中进行定位的方法，为研究烟草细胞自噬现象的分 子机理提供参考依据。
【附图说明】
[0018] 图 1为NtAtg8-pFF19-GFP载体酶切验证图，其中Μ为1Kb Plus DNA Ladder，l为 NtAtg8-pFF19-GFP 质粒酶切图；
[0019] 图2为NtAtg8-pFF19-GFP基因载体定位图。
【具体实施方式】
[0020] -种检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，以红花大金元烟草品种 为材料，提取RNA，反转录得cDNA，以NtAtg8-F/NtAtg8-R为引物对，进行PCR扩增NtAtg8基 因，双酶切体系处理DNA片段并回收，采用同样的双酶切体系处理pFF19-GFP质粒并回收;将 含有同样粘性末端的NtAtg8基因和pFF19-GFP载体进行连接，连接产物转化到DH5a感受态 细胞中，挑选阳性菌落测序验证。
[0021] 所述NtAtg8基因和PFF19-GFP载体连接的体系为:酶切后质粒各ΙμL、Buffer ΙμL、 T4连接酶ΙμL，补水至?ομL，16°C连接过夜。
[0022] 所述NtAtg8-F/NtAtg8-R引物对序列如SEQ ID N0:1/SEQ ID N0:2所示，其中 GGTACC为Kpn頂每切位点，GGATCC为Banffl酶切位点。
[0023] 所述NtAtg8基因的片段如SEQ ID N0:3。
[0024] 所述PCR扩增的反应条件如下：94°C预变性5min，94°C30s，62°C30s，72°C40s，35个 循环，再 72°C10min，16°C10min，4°C^：^#。
[0025] 所述双酶切体系为：BufferK 2.5yL，BamHI 2.5yL，SphI 2.5yL，模板20yL，加灭菌 水至50yL。
[0026] 一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体的应用，将NtAtg8-pFF19-GFP质粒转 入烟草悬浮细胞，通过激光共聚焦显微镜观察悬浮细胞，定位自噬体。
[0027] 所述将质粒转入烟草悬浮细胞的方法为基因枪介导转化法。
[0028] 所述基因定位表达载体在分析植物细胞自噬分子机理的应用。
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
[0030] (l)NtAtg8_pFFl9_GFP 质粒构建
[0031] 使用DNAMAN6.0，结合NCBI中收录的有关烟草Atg8基因编码序列设计引物对序列 如SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2所示。
[0032] 人工合成后使用Tris-EDTA ρΗ=8·0溶液稀释至工作浓度ΙΟμΜ。
[0033] 采用PCR的方法，模板为烟草红花大金元品种cDNA，扩增NtAtg8基因，PCR反应试剂 盒购自北京全式金生物技术有限公司。反应体系为：5yL 10X11 buffer，cDNA为2yL，上下 游引物各2.5yL，Trans Taq HiFi DNA聚合酶0.3yL，dNTP 4yL，加灭菌水至50yL。
[0034] 扩增条件为：94°C 预变性 5min; 94°C30s; 62°C30s; 72°C40s，35 个循环；72°C10min; 16°C10min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶中电泳检测并回收获得含有ΚρηΙ和BamM酶切位 点的双链DNA片段。
[0035]使用TaKaRa生物技术有限公司ΚρηΙ和BamHI酶切体系消化得到具有粘性末端的片 段，Buffer K 2.5yL，BamHI 2.5yL，SphI 2.5yL，模板20yL，灭菌水22.5yL，并采用同样的双 酶切体系消化PFF19-GFP质粒。
[0036]采用TaKaRa生物技术有限公司的Solution I连接酶将含有粘性末端的NtAtg8基 因与含有同样粘性末端的载体PF