一种叶用和根施农业生防制剂同时制备的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种叶用和根施农业生防制剂同时制备的方法，以及其在农作物病原 菌和根结线虫生物防治中的应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 植物线虫病是农作物、蔬菜、果树、林木、花卉及药材种植的四大病源生物之一，其 危害仅次于真菌，超过细菌和病毒。植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1000亿 美元，全球农业上最重要的危害线虫是根结线虫和胞囊线虫，我国较为严重的线虫有根结 线虫、大豆胞囊线虫、小麦粒线虫、甘薯茎线虫、水稻干尖线虫、栗线虫、松材线虫等，仅我国 农作物种植业线虫病损失就达600亿元。植物寄生线虫的防治通常靠化学杀线虫剂、栽培技 术、培育抗性品种和生物农药，但是目前仍无特效的化学农药，且由于潜在的环境问题，涉 及人类和动物健康，杀线虫剂的使用受到很大的限制。
[0003] 淡紫拟青霉能广泛寄生于线虫卵，杀虫效果高效，被认为是最具有应用前景的根 结线虫生防真菌，该菌具有功效高、寄生广、易培养等特点，特别是在控制植物病源线虫方 面功效显著。作为一种生物制剂，淡紫拟青霉在杀线虫过程中具有安全、高效、持效期长 等特点，其杀线虫的活性并不比化学杀线虫剂差，并有促进植物生长的作用。淡紫拟青霉除 了具有杀线虫效果外，还可以寄生半翅目、同翅目、等翅目和鞘翅目及鳞翅目等昆虫，另外 对植物病原菌具有拮抗作用。淡紫拟青霉的次级代谢物也有一定的生理效能，如产生类似 吲哚乙酸产物，促进植物根系和植株生长，对种子萌发和生长具有促进作用，还能产生多种 功能酶并具有一定的化学农药降解效应。
[0004] 壳寡糖是新一代海洋生物源农药，具有无毒害、不污染环境、兼有药效和肥效双重 生物调节功能的特点，可诱导激活植物免疫系统，提高植物抗病毒能力。壳寡糖是以壳聚糖 为原料，经酶法降解成的具有一定聚合度和结构的系列产物。壳寡糖可作为植物生长调节 剂，能够刺激植物的免疫系统反应，增强植物对病虫害的防御能力。壳寡糖作为植物免疫激 活因子的基础研究始于20世纪60年代，后来陆续报道壳寡糖对烟草花叶病毒病、稻瘟病 和纹枯病、核盘霉菌病原菌等植物病具有较好的防治作用，同时研究发现壳寡糖对植物体 内多种功能酶具有较好的诱导激活作用，并且可诱导植保素合成，此外壳聚糖对鳞翅目和 同翅目等害虫均具有一定的杀虫活性。壳寡糖的生防效果在烟草、水稻、番茄、棉花、小麦、 草莓、油菜、黄瓜、大豆、辣椒、木瓜等农作物中的防治效果均有很好的防效。因此壳寡糖具 有广谱抑菌活性并对人畜无毒，开发壳寡糖生物源农药是减少化学农药施用量的有效途 径。
【发明内容】
[0005] 本发明针对上述技术背景及其存在的不足，提供一种叶用和根施农业生防制剂实 现同时制备的方法，以及其在农作物病原菌和根结线虫生物防治中的应用。以淡紫拟青霉 YT08为出发菌株，经液体发酵的方法同时生产制备叶用和根施农业生防制剂，其中叶用农 业生防制剂对植物病原真菌有强抑制作用，根施农业生防制剂对根结线虫具有较强的杀灭 效果。
[0006] 本发明的目的可以通过如下措施来达到： 1. 一株具有防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉，该菌株具有高产壳聚糖酶 的特性，其保藏名称为:YT08,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期：2014年11月26日，保藏号为CGMCC No. 10026,分类命名：淡紫拟青霉 (Paecilomyces lilacinus)。
[0007] 2.菌种活化 活化培养基(g/L):蛋白胨3~5,酵母粉1~3,葡萄糖10~20,粉末壳聚糖2~5,磷酸二 氢钾1~3,硫酸镁1~2，磷酸氢二钠1~3，pH 7.0。50〇1111三角烧瓶中分装100ml活化培养 基，121°C灭菌20min。从试管斜面保存菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在30~32°C、 180 rpm下培养30~36 h至菌体浑池，制得活化种子液。
[0008] 3.液体发酵 (1)摇瓶培养 采用优选的培养基(g/L):甘油18~30,大豆蛋白胨25~40，MnS〇4 1~3,粉末壳聚糖 (90%以上的脱乙酰度）20~30,蟹壳粉10~15，NaCl 2~5，CaCl2 1~3，MgS〇4 1~3，FeS〇4 0.5~1.5，pH 5~6.5,每500ml三角烧瓶中分装200ml发酵培养基，121°C灭菌20min。按照 0.8~1.5%( v/v)的接种量接入活化的种子培养液，后入180rpm的旋转摇床中培养，控制温 度为30~34°C，发酵5-8d。
[0009] (2)发酵罐培养 采用优选的培养基(g/L):甘油18~30,大豆蛋白胨25~40，MnS〇4 1~3,粉末壳聚糖 (90%以上的脱乙酰度）20~30,蟹壳粉10~15，NaCl 2~5，CaCl2 1~3，MgS〇4 1~3，FeS〇4 0.5~1.5。以70%比例装入发酵培养基，经118°C蒸汽灭菌20min后，火焰圈保护条件下按照 0.8~1.5%( v/v)的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动栗控制发酵过程中的pH始终维 持在pH 5~6.5，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在30~34°C，溶解氧参数通过调节进 罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在10%以上，发酵4-7d。
[0010] 4.产品制备:淡紫拟青霉YT08的发酵液经10000r/min离心5min，分别收集菌体沉 淀物和发酵上清液，其中发酵上清液收集灌装后可直接作为叶用农业生防制剂使用，同时 包含部分未降解壳聚糖等的菌体沉淀物即作为根施农业生防制剂使用。制备的根施农业生 物制剂经称重确定单位发酵液体积中的菌体含量，同时叶用农业生防制剂经DNS法分别测 定壳聚糖酶活力和壳寡糖的含量。
[0011] 所用的壳聚糖酶测定方法:叶用农业生防制剂稀释到合适的梯度，取0.2 mL加水 至lml，再加入lmL胶体壳聚糖底物溶液（1%质量分数），在40°C水浴中保温反应20 min，加 DNS试剂3 mL，沸水浴5 min，定容至25ml后取4ml反应样液在5000 rpm下离心10min。以对 照组作为空白在520 nm处测定0D值，根据DNS标准曲线，计算其酶活力。空白对照组:0.2 mL 稀释到相同梯度的叶用农业生防制剂，加水至lml，沸水浴5min灭活，再加入相同体积的壳 聚糖溶液和DNS试剂，处理方法同样品组。酶活计算：以单位体积(mL)单位时间(min)水解产 生的氨基葡萄糖的umol数为酶活力的定义单位。
[0012] 所用的标准曲线制作:精确称取100°C干燥至恒重的氨基葡萄糖盐酸盐0.13 g，加 蒸馏水溶解并定容至100 ml，配成.6 umol/mL浓度的溶液。按不同浓度梯度在各25mL比色 管中分别加入1 mL标准氨基葡萄糖溶液、1 mL的超纯水和3mL的DNS显色液，沸水浴反应5 min，定容至25ml后于520mn下测0D值，并绘制标准曲线。
[0013] 所用的壳寡糖含量测定方法:在分光光度法的精准检测限内，将叶用农业生防制 剂稀释到合适的梯度，在各25mL比色管中分别加入稀释后叶用农业生防制剂lmL、lmL的超 纯水和3mL的DNS显色液，沸水浴反应5 min，定容至25ml后于520mn下测0D值，根据标准曲线 确定壳寡糖的量并计算单位体积中叶用农业生防制剂的壳寡糖总量。
[0014] 本
【发明内容】
的有益效果在于： 1.淡紫拟青霉YT08 CGMCC No. 10026是一株对农作物根结线虫具有强防治效果的丝 状真菌，施入土壤后可以在植物根部定殖，通过自身特性产生大量的壳聚糖酶、几丁质酶等 水解蛋白酶类，作为侵染因子进入根结线虫内部，起到杀灭根结线虫的效果，因此发酵后的 淡紫拟青霉YT08菌体可以作为根施的农业生防制剂。
[0015] 2.发酵培养基中中添加过量的粉末壳聚糖和蟹壳粉，除一部分转化为壳寡糖外， 还有部分未降解的壳聚糖、几丁质作为根结线虫生物防治的辅助因子，另外其还可以抑制 多种植物病原菌，与菌体一起收集使用，形成生物防治的协同效应，与淡紫拟青霉YT08-起 作为根施的农业生防制剂。
[0016] 3.利用淡紫拟青霉YT08高产壳聚糖酶的特性，在菌体发酵过程中添加粉末壳聚 糖诱导产生壳聚糖酶，同时生成的壳聚糖酶又将培养基中的壳聚糖降解转化为高生理活性 的低分子量壳寡糖，壳寡糖以溶解的方式存在于发酵液中，且对多种植物病原菌具有抑制 作用，因此壳寡糖可以作为生物农药，经叶面喷洒后用于防治植物叶面的病原菌危害。
[0017] 4.淡紫拟青霉YT08在发酵培养过程中还会产生众多的次生代谢产物，其多溶解于 水，可以促进农作物生长，且对植物病原菌的抑制具有一定的增效作用，因此这些组分与生 成的壳寡糖形成协同效应，经叶面喷洒后用于防治植物叶面的病原菌危害。
[0018] 本发明的突出优势在于： 1.利用淡紫拟青霉YT08 CGMCC No. 10026高产壳聚糖酶及部分几丁质酶的特性，发酵 生产过程中添加粉末壳聚糖和蟹壳粉，实现在一种发酵工艺中同时制备根施和叶用农业生 防制剂，节省设备投资，减小生产场地，降低生产成本。
[0019] 2.培养容易，操作方法简单高效，且由于淡紫拟青霉YT08对多数病原菌具有抑制 作用使其培养过程中不易染菌。
[0020] 3.本发明中制备的根施和叶用农业生防制剂，分别对根结线虫和植物病原菌具 有强抑制作用，市场前景广阔。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限 制本发明的保护范围。
[0022] 实施例1摇瓶培养同时制备叶用和根施农业生防制剂 从试管斜面保存菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在30°C、180 rpm下培养32 h至 菌体浑浊，制得活化种子液。活化培养基(g/L):蛋白胨3,酵母粉1，葡萄糖10,粉末壳聚糖2， 磷酸二氢钾1，硫酸镁1，磷酸氢二钠1，ρΗ 7.0。50〇!111三角烧瓶中分装100ml活化培养基， 121°C 灭菌 20min。
[0023] 采用优选的培养基(g/L):甘油18,大豆蛋白胨25，MnS〇4 1，粉末壳聚糖(90%以上 的脱乙酰度)20,蟹壳粉 10，NaCl 2，CaCl2 l，MgS〇4 l，FeS〇4 0.5，pH 5,每500ml三角烧瓶中 分装200ml