生产藻类细胞培养物和生物质、脂质化合物和组合物以及相关产品的方法
【专利说明】生产藻类细胞培养物和生物质、脂质化合物和组合物以及相 关产品的方法 发明领域
[0001]本发明涉及生产藻类生物质和细胞培养物以及脂质化合物及其组合物(包括脂肪 酸、类胡萝卜素和脂溶性维生素）的方法。本发明进一步涉及制备相关食品和工业和药物组 合物的方法。在各个示例性实施方案中，所述方法包括使藻类在基于汁液的培养基(包括不 含化学添加剂和防腐剂的培养基）中生长，以生产藻类细胞培养物、藻类生物质、脂质化合 物和组合物和相关产物，所有都可以是认证为有机的。
[0002] 背景 藻类(包括微型和大型-藻类)是栖居地球上的大部分生态系统的生物体的多元化群 体。藻类最通常通过色素分类。绿色藻类或绿藻含有叶绿素 a和b。红色藻类或红藻含有叶绿 素 a和藻胆色素。褐色藻类，被称为杂色藻类，含有叶绿素 a和c，但缺乏叶绿素 b。
[0003] 水产养殖中利用的藻类物种的实例包括：眼点拟微绿球藻（Nannochloropsis oculata)(2_4 μπι)，球等鞭金藻（Isochrysis galbana)(5_7 μπι)，裂殖壶菌属种 (SSchizochytrium sp · )，chuii 四爿藻（Tetraselmis chuii ) (7-10 譲），纤细角毛藻 (Chaetoceros gracilis) (6-8 μπι)，盐生杜氏藻（Dunaliella tertiolecta) (7-9 μπι)，以 及小球藻属(〇11〇代113)(直径3-9以111)、菱形藻属(附七2 8(311丨3)和衣藻属(〇1131117(1〇1]1011&8) 的几个种。
[0004] 水生环境的化学特征在决定藻类生长速率和生物质质量中发挥重要作用。通常， 用于培养微型藻类的培养基的组成共有几个共同特征。一些营养素必须以相对高浓度提 供。这些营养素，被称为常量营养素，是碳(C)、氮(Ν)、磷（Ρ)、钠(Na)、硫（S)、钾（Κ)和镁 (Mg)。还必须提供以较低浓度的必需的微量营养素。这些微量营养素包括锰(Mn)、锌(Zn)、 铜(Cu)、钼(Mo)和钴(Co)、铁(Fe)、氯(Cl)、钙(Ca)和硼(Bo)。藻类生长需要这些营养素。藻 类培养基中存在的常量和微量营养素的摩尔化学计量是培养基的关键特征，且当开发或改 进培养基配方时必须注意这些比率。
[0005] 如同所有活生物体，必须提供藻类能够同化的碳源给合成的藻类生长培养基。以 二氧化碳的形式提供的碳被称为无机碳。该碳通过光合作用的过程固定。一些藻类可以完 全在无机碳源上生长，且该生长模式被称为光合自养生长。大多数藻类的种可以呈现光合 自养生长模式。一些藻类也可以具有不需要光合作用而从有机碳源获得能量的能力；该生 长模式被称为异养生长模式。其它藻类可以同时利用光和二氧化碳以及有机碳源用于生 长，这被称为混合营养生长。在混合营养或异养生长模式的情况下，用于培养微藻的碳源包 括葡萄糖、右旋糖、乙酸酯和甲醇(还原性碳源）。
[0006] 补充至藻类生长培养基的常见氮源是硝酸盐(N〇3)、亚硝酸盐（（N02)、铵(NH4)、尿 素、氨基酸(谷氨酸单钠或精氨酸）、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白、非有机酵母提取物和玉米浆 液体。
[0007] 磷、硫和镁都是必需营养素，其添加是藻类生长需要的。硫酸盐(S04)是通常添加 至合成藻类生长培养基的硫的形式。无机磷酸盐(H 2P04或HP〇4)是通常提供至藻类培养基的 磷的形式;然而，也可以使用有机磷酸盐的形式。过量磷酸盐已经与新鲜水和海洋生态系统 两者中的藻类大量繁殖联系起来。
[0008] 铁是在藻类细胞中的细胞代谢和能量产生中发挥重要作用的关键元素。通常，铁 的三价铁和亚铁形式容易由微藻同化。补充铁的早期尝试经常导致铁从溶液沉淀出。因此， 许多配方需要铁悬浮于化学螯合剂中，通常为乙二胺四乙酸(EDTA)钠。EDTA螯合其它痕量 元素诸如铜、钴和镉。
[0009] 被称为痕量元素的其它元素必须补充至合成藻类培养基中。铜、锰、钼和锌是通常 包括于痕量元素的溶液中的金属。钒、硼和钴有时同样包括于痕量元素中。具有高浓度的这 些金属的补充是有毒的，因此必须小心不过量添加它们。将化学螯合剂诸如EDTA添加至含 有这些金属的溶液通常用于防止沉淀。
[0010]已经表明，添加维生素可以改变裂殖壶菌属(Schizochytrium)的脂肪酸组成且改 善其它种类的藻类的生物质产量。因此，合成生长培养基的许多制剂包括添加的维生素。 [0011]藻类的一种商业应用是它们生产有商业价值的脂质和亲脂性化合物诸如各种脂 肪酸和抗氧化剂的能力。例如，ω-3脂肪酸是对身体和心理健康重要的营养素。这些必需脂 肪酸支持心血管、生殖、免疫和神经系统健康。ω-3脂肪酸在脑中高度集中，且似乎对于认 知(脑记忆和性能）和行为功能是重要的。事实上，在妊娠期间没有从其母亲得到足够ω-3 脂肪酸的婴儿处于发展视觉和神经病况的风险中。
[0012] 破囊壶菌属(Thraustochytrids)是就生产ω -3脂肪酸而言已经是的重要研究和 开发的焦点的微藻。已知破囊壶菌属合成和积累多不饱和脂肪酸(PUFA)，诸如二十二碳六 稀酸(DHA; C22:6 η-3)。从破囊壶菌属工业生产DHA在过去二十年已经大大推进。导致从这些 种类的藻类经济生产DHA的关键特征是它们在异养培养基中生长的能力。当在发酵容器生 长时，包括葡萄糖作为碳源和MSG、玉米浆液体或酵母提取物作为氮源的异养培养基的制剂 产生高细胞浓度、快速生长速率和显著量的DHA。除了碳和氮以外，将磷酸盐、硫酸盐、铁、 磷、钠、硫、钾、镁和痕量元素补充至合成藻类培养基中。在其中使用更复杂化学添加剂诸如 玉米浆液体和酵母提取物的情况下，可以省略痕量元素和维生素，因为这些添加剂含有足 量这些营养素。
[0013]通常，用于培养微藻的异养培养基的先前所述配方总是含有化学添加剂。痕量元 素也源自化学来源。常量和微量营养素经常是化学衍生的。玉米浆液体是源自湿磨玉米的 工业副产品，经常向所述浆中注入化学品二氧化硫气体以促进玉米籽粒的软化。氮源诸如 铵、硝酸盐、MSG都是其中需要化学品来合成或分离产物的工业过程的产物。使用含有源自 化学品的营养素的培养基产生非有机酵母提取物。已经提出用于工业生产破囊壶菌属的其 它化合物是gelysate、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白、尿素、乳清或玉米蛋白粉，都是其中需要 化学品来合成或分离产物的工业过程的产物。此类培养基不适合用于生产藻类和藻类衍生 的组合物和不含化学品或认证为有机的化合物。
[0014] 美国国家有机计划(US National Organic Program)建立了关于有机实践和标记 的规则。概述了允许和不允许的物质，且添加至国家列表中。所述列表包括合成衍生的物 质，诸如DHA和EPA。在Ν0Ρ准则下不允许的物质是非有机酵母和源自非有机酵母的产物、合 成衍生的硫酸盐和合成衍生的痕量元素，仅举几例。鉴于1) USDA确定了它们提供健康益处 和2)有机替代物不可得到，在现有法律下已经允许多达5%的非有机物质。已经允许含有合 成衍生的DHA的有机产品进行销售和出售。藻类DHA行业已经主张无法开发用于有机生产藻 类DHA的方法。因此，将非有机藻类油添加至有机标记的婴儿配方和其它食物仍存在争议。 [0015]因此，需要商业规模生产不含化学添加剂和防腐剂的藻类及其构成组分，包括认 证为有机的那些，以用于食物、药物和美容品和工业产品中。
[0016] 概述 提供用于生产藻类培养物、生物质、脂质化合物和脂质组合物和相关产品的方法。
[0017] 在一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方法， 其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养物，其 中所述培养基包含来自一种或多种水果的汁液、氧源和氮，其中所述培养基是灭菌的，且其 中所述培养基中的氮由天然氮组成。
[0018] 在另一个说明性实施方案中，培养基可以补充有盐源。在另一个说明性实施方案 中，所述盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可以具有约10 PPt至约35 ppt的范围内的盐度。
[0019] 在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的培养基可以补充有糖。在另一 个实施方案中，所述糖可以是右旋糖或果糖。在另一个实施方案中，所述糖可以是认证为有 机的。
[0020] 在另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮、糖和盐源组成。在 另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮和糖组成。在又另一个说明性 实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮和盐源组成。
[0021] 在另一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方 法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养 物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、糖、盐 源、氧源和氮组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
[0022] 在另一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方 法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养 物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、糖、氧 源和氮组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
[0023] 在另一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方 法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养 物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、盐源、 氧源和氮组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
[0024] 在进一步说明性实施方案中，前述四段的任何实施方案的糖可以是右旋糖或果 糖。在一个进一步说明性实施方案中，所述糖可以是认证为有机的。在另一个说明性实施方 案中，前述四段的任何实施方案的盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可 以具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
[0025] 在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方 法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基包 含来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮，其中所述 培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
[0026] 在另一个说明性实施方案中，前述段落的实施方案的培养基可以补充有盐源。在 另一个说明性实施方案中，所述盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可以 具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
[0027] 在进一步说明性实施方案中，前述两段的任何实施方案的培养基可以补充有糖。 在另一个实施方案中，所述糖可以是右旋糖或果糖。在另一个实施方案中，所述糖可以是认 证为有机的。
[0028] 在另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮、糖和灭菌的盐源 组成。在又另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮和糖组成。在另一个 说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮和盐源组成。
[0029] 在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方 法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基由 来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源、氮、盐源和糖组 成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
[0030] 在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方 法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基由 来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源、氮和盐源组成，其 中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
[0031] 在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方 法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基由 来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源、氮和糖组成，其中 所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
[0032] 在进一步说明性实施方案中，前述四段的任何实施方案的糖可以是右旋糖或果 糖。在一个进一步说明性实施方案中，所述糖可以是认证为有机的。在另一个说明性实施方 案中，前述四段的任何实施方案的盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可 以具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
[0033] 在各个说明性实施方案中，任何上述实施方案的化合物可以是脂肪酸、类胡萝卜素 或脂溶性维生素。在一个进一步说明性实施方案中，所述脂肪酸可以是多不饱和脂肪酸。在 一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以选自DHA、EPA、DPA和松油酸。在一 个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是DHA。在一个进一步说明性实施方 案中，所述多不饱和脂肪酸可以是EPA。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂 肪酸可以是松油酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是DPA。在 一个进一步说明性实施方案中，所述类胡萝卜素可以是胡萝卜素。
[0034] 在一个进一步说明性实施方案中，提供生产用于人或动物的食品、美容品、工业组 合物或药物组合物的方法，其包括以下步骤:使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获 藻类生物质或藻类细胞培养物，其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或水果和 蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由 天然氮组成;从所述培养基收获藻类生物质或藻类细胞培养物;和制备所述食品、工业组合 物或药物组合物。
[0035] 在一个进一步说明性实施方案中，前述段落的方法可以进一步包括从所述藻类生 物质或藻类细胞培养物提取一种或多种脂质化合物或其组合物和制备所述食品、工业组合 物或药物组合物。在一个进一步说明性实施方案中，所述脂质化合物可以是脂肪酸、类胡萝 卜素或脂溶性维生素。在一个进一步实施方案中，所述脂肪酸可以是多不饱和脂肪酸。在一 个进一步实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以选自DHA、DPA、EPA和松油酸。在一个进一步 说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是DHA。在一个进一步说明性实施方案中，所 述多不饱和脂肪酸可以是EPA。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以 是松油酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述类胡萝卜素可以是胡萝卜素。
[0036] 在进一步说明性实施方案中，上面前述两段的任何实施方案的培养基可以补充有 盐源。在一个进一步实施方案中，所述盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海 水可以具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
[0037] 在进一步说明性实施方案中，上面前述三段的任何实施方案的培养基可以补充有 糖。在一个进一步实施方案中，所