一种kpv肽及其类似物的多肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽的制备方法，尤其涉及一种KPV肽及其类似物的多肽的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 黑色素细胞激素（英文名melanocyte-stimulatinghormone，缩写MSH)中的a-MSH 的一段多肽SYSMEHFRWGKPV-NH2,被发现具有多种生物用途。在过去几十年，有许多研究报 道，a-MSH用于皮肤消炎和其他炎症疾病。此多肽序列中，四肽HFRW以及其同系物序列，包括 非多肽类似物，已经被许多制药公司和研究所合成并用于生物医疗领域。人们还发现，这条 多肽序列的C端，$负氨酸-脯氨酸-缴氨酸（英文名Lysine-Proline-Valine，缩写KPV)，已经 在多项研究中被证明具有预防和皮肤炎症的功效。其类似结构的多肽序列:MEHFRWGKPV、 HFRWGKPV、OSSYSMEHFRWGKPV，与三肽KPV有着相同或者相似的功效，可以预防和治疗一系列 复杂的皮肤适应症，包括皮肤炎症，水肿，红斑，机会性感染和瘙痒，以及牛皮癣等。 MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、OSSYSMEHFRWGKPV比KPV更加稳定，药物半衰期时间更长，药物药效 持续效果更久(W02002080858A2)。表1为氨基酸的缩写对照表。
[0003] 目前，合成KPV肽的方法有液相法和固相法两种（专利US20100120699A1)。液相制 备法合成时间长，副产物多，产率低，专利报道中为33%，溶剂消耗量大。
[0004] 现有的固相制备法，以N，N'_二环己基碳二亚胺（缩写：DCC)和羟基苯并三唑（缩 写:HOBt)作为多肽连接的反应物质，以N-乙酰基咪唑（英文名:N-acetylimidazole)将N端 羧基化，再通过氢氟酸将多肽从固相树脂上切割。该方法虽然可以将产率提高到56%，但仍 然相对繁琐，合成成本高，反应物化合物的使用比较危险。
[0007] 表1氨基酸的缩写对照表
【发明内容】
[0008] 为了获得更高的产率，提高反应速率，反应更安全，本发明提供一种KPV肽及其类 似物的多肽制备方法，以全固相合成法合成，包括以下步骤：
[0009] 步骤一、使用聚合物键合型聚氧乙烯-RAM树脂作为合成的固相基质并对其进行预 处理；
[00?0]步骤二、向树脂中加入N-荷甲氧羰基-ΑΑ-0Η、多肽连接试齐丨」进行氨基酸合成，清洗 树脂，脱去N-芴甲氧羰基保护，再次清洗树脂；
[0011]步骤三、将步骤二中得到的肽链以醋酸、二氯甲烷进行羧基化反应得到羧基化的 肽链；
[0012] 步骤四、以三氟乙酸、三异丙基硅烷、水混合溶液，或者氢氟酸、三异丙基硅烷、水 混合溶液，将步骤三得到的羧基化的肽链进行切割，切割后得到的多肽溶液用甲基第三丁 基醚清洗，离心沉淀，干燥沉淀物，以制备型HPLC纯化得到KPV肽或者其类似物的多肽；
[0013]N-芴甲氧羰基-AA-OH中的AA表示氨基酸，步骤二至少重复三次再进入步骤三，N-芴甲氧羰基-AA-OH至少要以N-芴甲氧羰基-Val-OH、N-芴甲氧羰基-Pro-OH和N-芴甲氧羰 基-Lys-OH形式分别出现一次；
[0014]多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯、N，N'_二异丙基碳二亚胺、N，N'_二环己基碳 二亚胺、羟基苯并三唑、〇-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯 烷基六氟磷酸盐、6-氯-1H-苯并三唑、N，N-二异丙基乙基胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N， Ν'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯中的一种或者多种。
[0015]进一步地，多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯、N，N'_二异丙基碳二亚胺。
[0016]进一步地，多肽连接试剂包括N，N-二异丙基乙基胺、2-( 7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，Ν'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯。
[0017] 进一步地，多肽连接试剂包括1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、N，N'_ 二异丙基碳二亚胺。
[0018] 进一步地，多肽连接试剂包括N，N二环己基碳二亚胺和羟基苯并三唑，或者0-苯 并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N'_二异丙基碳二亚胺，或者6-氯-1H-苯并三唑和N， Ν'-二异丙基碳二亚胺。
[0019] 进一步地，步骤一中的预处理是指：以哌啶、二甲基甲酰胺脱去聚合物键合型聚氧 乙烯-RAM树脂的Ν-芴甲氧羰基基团保护，以二甲基甲酰胺或者Ν-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯 甲烷清洗树脂。
[0020] 进一步地，步骤二中的清洗树脂，脱去N-芴甲氧羰基保护，再清洗树脂具体是指： 以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗树脂，以哌啶、二甲基甲酰胺脱 去N-芴甲氧羰基基团保护，再以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗树 脂。
[0021] 进一步地，脱去N-芴甲氧羰基基团保护是在加热到70°C_90°C条件下进行的。
[0022] 进一步地，加热是指用微波、水浴或者油浴加热。
[0023 ]进一步地，脱保护的反应时间是2分钟。
[0024]进一步地，步骤二中的氨基酸合成是在加热到70°C_90°C条件下进行的，反应时间 是5分钟，加热方式是微波加热。
[0025]进一步地，还包括步骤五、将步骤四得到的得到KPV肽或者其类似物的多肽冷冻干 燥，于-20°C保存。
[0026] 进一步地，步骤四中HPLC的流动相为水和乙腈。
[0027] 进一步地，其类似物的多肽包括MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV。
[0028] 进一步地，步骤二中的氨基酸合成是在加热到70°C_90°C条件下进行的，反应时间 是5分钟，加热方式是微波加热;还包括步骤五、将步骤四得到的得到KPV肽或者其类似物的 多肽冷冻干燥，于_20°C保存；步骤四中HPLC的流动相为水和乙腈；其类似物的多肽包括 MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV;
[0029]多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯和N，N'_二异丙基碳二亚胺，或者N，N_二异丙 基乙基胺和2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯，或者lH-苯并三唑- l-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐和N，N'-二异丙基碳二亚胺；
[0030] N-芴甲氧羰基-AA-0H中的AA表示氨基酸，氨基酸包括缬氨酸、脯氨酸、赖氨酸；
[0031] 步骤一和步骤二中清洗树脂用的二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯 甲烷的用量为3~5mL/次。
[0032]进一步地，N-芴甲氧羰基-ΑΑ-0Η中的AA表示氨基酸，氨基酸包括3-氯-D-苯丙氨 酸。
[0033] 本文中，聚合物键合型聚氧乙烯-RAM的英文名是GentaGelSRAM;N-芴甲氧羰基 的英文缩写是Fmoc;N-芴甲氧羰基-ΑΑ-0Η的英文缩写是Fmoc-AA-〇H;N-芴甲氧羰基-Val-〇H的英文缩写是Fmoc-Val-〇H;N-芴甲氧羰基-Pr〇-0H的英文缩写是Fmoc-Pr〇-0H;N-芴甲氧羰 基-Lys-ΟΗ的英文缩写是Fmoc-Lys-ΟΗ;二甲基甲酰胺的英文名是dimethylformamide，缩写 是DMF;N_乙酰基咪唑的英文名是N-acetylimidazole;三异丙基硅烷的英文名是 triisopropylsilane; 2_ 月亏氛乙酉爱乙酯的英文名是ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate;N， Ν'-二异丙基碳二亚胺的英文名是N，N' -diisopropylcarbodiimide，缩写是DIEA;N，N'_二 环己基碳二亚胺的英文名是(1；[05^10116171031'130(1；[；[111丨(16，缩写是0(^ ;羟基苯并三唑的英文 名是l-hydroxybenzotriazole，缩写是H0Bt;0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯的英文名 ^0(7Azabenzotriazollyl)NNN'N，tetramethyluroniumhexafluophosphate，缩写是 冊1!];1!1-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐的英文名是&61^〇^丨 &2〇1-111-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate，缩写是PyBOP; 6-氯-1H-苯并三挫 的缩写是PyClock;2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯的英文名是0_ (7-Aza-lH-benzotriazol_l-yl)-N，N，N'，Ν'-tetramethyluronium hexafluorophosphate，缩写是HATU;叔丁氧羰基的英文名是tert-Butyloxycarbonyl，缩写 B0C〇
[0034] 有益效果是：
[0035] (1)本方法相对于液相合成法具有更高的产率，总产率可比液相制备法提高近2 倍，达65%。副产物无论从种类还是质量都更少，只需要一步分离即可将纯度达到90%以 上。
[0036] (2)在脱保护反应中，由于常温法需要20分钟，微波法需要2分钟;在连接氨基酸反 应中，常温法需要1小时，微波法需要5分钟。因此微波法可以将普通固相反应速率提高10倍 以上。
[0037] (3)由于微波法副产物非常少，不需要大量溶剂清洗，比如常温