一种产碱性脂肪酶的黑曲霉突变菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产碱性脂肪酶的黑曲霉突变菌株。 技术背景
[0002] 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性 酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的 活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶具有广泛的应用价 值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应 用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。
[0003]碱性脂肪酶是在碱性条件下水解的脂肪酶，生产的主要原料为小麦、玉米等农副 产物，通过生物发酵技术转化。它可以水解天然油脂，生产脂肪酸和甘油，是一种专门在异 相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。
[0004]目前碱性脂肪酶主要应用于洗涤剂行业，单独或与碱性蛋白酶一起添加在洗涤剂 中，作为洗涤剂的一种添加成分，它有助于脂肪油渍和人体皮脂污垢的去除。1988年，丹麦 NoVo公司报道了碱性脂肪酶在洗涤剂中的应用，并将其投入到工业化生产中。日本狮子油 脂公司同年也推出了加脂肪酶的洗衣粉。P&G公司和联合利华公司等中外合资公司也推出 了含脂肪酶和蛋白酶的高档洗衣粉。国内对碱性脂肪酶的研究起步较晚，在碱性脂肪酶发 酵菌种、提取工艺、酶活性以及颗粒酶制备技术等方面与国外的先进技术有很大的差距，尤 其是产品的生产成本远高于国外同类产品，缺乏竞争力，所以现在急需开发碱性脂肪酶高 产菌株，促进碱性脂肪酶的广泛应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株产碱性脂肪酶的黑曲霉突变菌株及其应用，是将来源于 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)的碱性脂肪酶基因转化入黑曲霉宿主菌 中，构建高效表达碱性脂肪酶的黑曲霉工程菌;然后通过基因敲除手段敲除宿主菌自身的 淀粉酶基因，再筛选获得碱性脂肪酶产量明显提高的突变菌株，为该酶的广泛应用奠定了 基础。
[0006]本发明一方面提供了一种黑曲霉工程菌，其携带有表达碱性脂肪酶基因的重组质 粒。
[0007] 所述的碱性脂肪酶，其氨基酸序列为SEQIDNO: 1;其编码基因的序列为SEQID N0:2〇
[0008] 本发明一方面提供了一株突变菌黑曲霉Su-L2(AspergillusnigerSu-L2)，已于 2015年12月16日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0：M2015761〇
[0009]本发明所述黑曲霉Su-L2在生产碱性脂肪酶中的应用。
[0010] 本发明构建的黑曲霉工程菌SU-L1，在30L发酵罐发酵条件下其碱性脂肪酶活力达 到10089u/ml，蛋白表达量为4.54g/L。为了进一步提高其产酶能力，本发明通过基因敲除手 段敲除宿主菌自身的淀粉酶基因，筛选获得的突变菌株黑曲霉Su-L2,其碱性脂肪酶活力达 到15766u/ml，蛋白表达量为5.4g/L，比突变前分别提高了 56.3 %和18.9 %，有利于该酶的 广泛应用。
【附图说明】
[0011]图1为质粒pGAU图谱；
[0012]图 2 为质粒pMD18T-pyrG图谱。
【具体实施方式】
[0013]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBI0L0GY(Ausubel，2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载 的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体 实施例的限定。
[0014]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0015]实施例1碱性脂肪酶基因的获得
[0016]根据公共基因数据库中的基因序列，由上海捷瑞公司合成碱性脂肪酶基因LipN (序列为SEQIDN0:2)，其编码的氨基酸序列为SEQIDN0:1。
[0017] PCR引物和反应条件如下：
[0018]引物1(F) :ATGCGGTCCTCCCTGGTGCTG
[0019]引物2(R) :TCACAGACAGGTGCCGATCAG
[0020] 反应条件为：94°C变性5min;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸45s，30个 循环后，72°C保温10min。琼脂糖电泳结果显示，LipN基因大小为876bp。
[0021] 实施例2重组载体构建
[0022] PCR扩增碱性脂肪酶基因，引物两端引入Xbal位点。引物序列如下：
[0023]引物3(F) ：GCTCTAGAATGCGGTCCTCCCTGGTGCTG
[0024]引物4(R) ：GCTCTAGATCACAGACAGGTGCCGATCAG
[0025]PCR反应条件为：94°C变性5min;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸45s，30 个循环后，72°C保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，LipN基因为大小876bp的片段。
[0026]将上述获得的碱性脂肪酶LipN片段与表达载体pGAU分别进行限制性内切酶Xbal单酶切，酶切条件如下：
[0028] 37°C水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ulddH20。用T4DNA 连接酶进行连接，连接体系如下：
[0030] 22°C连接lh，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37°C培养过夜后长出单 菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有碱性脂肪 酶基因LipN的重组载体pGAU-LipN。
[0031]实施例3碱性脂肪酶LipN的重组表达
[0032]原生质体制备:接种黑曲霉宿主Su2-1于PDA+U平板，30°C培养5-7d。割取2cmX2cm大小的菌块，接种l〇〇ml液体PDA+U培养基中，30°C培养24h生长菌丝体，用于转化。将长好的 菌丝体过滤后，用20ml1.2M硫酸镁溶液重悬，加入0.2g溶菌酶。30°C、lOOrpm培养2-3h。将 裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心lOmin获得原生质体。
[0033]转化:原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生 质体浓度达到1〇8。200ul原生质体中加入10ul准备好的质粒，加入50ul25 %的PEG6000，冰 浴20min，再加入2ml25 %的TOG6000室温放置5min，加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀。倒入 50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30°C培养箱 中倒置培养5d。
[0034] 转化子筛选:培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30°C培 养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30°C培养5-7d。每个转化子割取2cm X2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基中发酵，32°C培养5d，每天加入适量氨水， 控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行蛋白电泳检测，筛选出 有明显蛋白条带表达的重组菌株即为阳性转化子。
[0035] 将其中一个阳性转化子命名为黑曲霉Su_Ll(Aspergillus niger Su_Ll)。
[0036] 实施例4:U缺陷型菌株筛选
[0037] 将上述黑曲霉Su-Ll接种至PDA平板，30°C培养7d，吸取lml无菌水洗脱孢子，稀释 一定倍数使孢子浓度在1X1〇5个/ml。涂布BT平板(PDA中添加终浓度1.5g/L的5-氟乳