猪特异性友好位点Pifs302及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及猪特异性友好位点Pifs302。
【背景技术】
[0002] 在转基因动物的生产过程中，外源基因能否实现在转基因动物中高效稳定的表 达，是转基因技术的关键。外源基因在受体动物基因组中随机整合，会由于位置效应表达量 不稳定，受到表观修饰发生转基因的沉默。为了实现外源基因的持续稳定表达，定点转基因 能够解决位置效应带来的各种问题。近年来出现ZFN和TALEN技术，以及新出现的CRISPR/ Cas9技术，为基因的定点整合和基因敲除提供了新的工具，提高了转基因的效率，并在多个 物种中都已经获得了成功。但是，定点转基因的关键之一在于一个好的整合位点的选择，一 个好的位点能够使不同类型的外源基因表达盒稳定一致的表达，对动物细胞或者动物个体 没有不利影响。目前在大动物中关于安全位点的研究比较少。因此在猪中找到这种适合外 源基因整合的位点是非常重要的。
[0003] 基因组中的安全位点是染色体中的一个位点，整合在这个位点的转基因能够在多 个组织中稳定可靠的表达，而且能够适应不同类型的转基因表达盒的表达，对内源的基因 结构和表达没有不利的影响。但是，外源DNA与寄主基因组序列之间的相互作用，会影响转 基因整合的可靠性和安全性。虽然目的基因的转导已经取得了巨大的进步，但是基因插入 到受体基因组中什么样的位点才能使安全性和效率最高却很少被研究。
[0004] CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas (CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通过 序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒。CRISPR/Cas系统可以作 为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效。 2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小鼠、 大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂（doublestrand break，DSB)，细胞可通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)进行修复， 导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核苷酸共 同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。2014年，ScottJG等利用CRISPR/Cas介导的同源重 组在斑马鱼上实现了基因的替换。HuiYang等利用相同的策略一步获得了带有报告基因的 小鼠。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研 究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。
[0005] CRISPR/Cas9介导同源重组已在斑马鱼、原虫、小鼠、大鼠上实现基因的精确编辑， 但在家畜大动物上尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪特异性友好位点 Pifs302及其应用。
[0007]为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0008] 第一方面，本发明提供了一个猪特异性友好位点Pifs302,所述友好位点Pifs302 在基因组上的位置为:第15号染色体上第137957233bp(NC_010457.4,基于猪基因组序列信 息版本号Sscrofal0.2,2011 年9月）。
[0009]所述友好位点可用于外源基因的稳定表达，解决转基因过程中外源基因表达的不 稳定以及位置效应的不可预知性等问题。
[0010]第二方面，本发明提供了特异性靶向所述友好位点Pifs302的sgRNA。
[0011]以及转录所述sgRNA的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。
[0012]第三方面，本发明提供了针对所述友好位点PifS302的CRISPR/Cas9打靶载体，所 述打靶载体发挥切割载体功能。
[0013] 进一步地，所述打靶载体的构建方法包括如下步骤：
[0014] 1)将前述DNA序列进行互补配对，形成双链DNA;
[0015] 可选的，将所述DNA序列与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列进行互补配对，形成双 链DNA;
[0016] 2)将PX330骨架载体用限制性内切酶Bbsl进行酶切过夜，回收后，与步骤1)得到的 双链DNA连接，即得。
[0017]其中，所述PX330骨架载体为本领域常规载体，可购自Addgene公司。
[0018]作为优选，本发明提供一个最佳的互补配对反应程序，具体为:94°C变性5min，35°C退火lOmin，0~4°C保存。可选的，可将反应物放置在冰上进行保存。
[0019]第四方面，本发明提供了针对前述友好位点的同源重组载体，所述载体含有两端 带有Pifs302位点同源左臂和同源右臂的外源目的基因。
[0020] 进一步地，所述同源重组载体的构建方法，包括如下步骤：
[0021] 1)以猪细胞基因组DNA为模板，利用SEQIDNo. 3和SEQIDNo.4所示引物序列扩 增Pifs302位点的同源右臂，利用SEQIDNo.5和SEQID如.6所示引物序列扩增？丨€8302位 点的同源左臂；
[0022] 2)将外源目的基因通过NheI和NotI限制性内切酶连入同源重组载体。
[0023] 更进一步地，所述外源目的基因的两端带有ΙοχΡ序列，一端为突变型ΙοχΡ，序列如SEQID吣.7所示，另一端为野生型1(^卩。
[0024]在本发明的一个【具体实施方式】中，为了验证所述前述位点的友好性，所述外源基 因为来自pEGFP-ΝΙ载体的表达单元EGFP(报告基因）。
[0025]第五方面，本发明提供了一种转基因方法，将前述打靶载体与前述同源重组载体 按物质的量1:1的比例混合，用电击转染或脂质体转染的方法共转入猪成纤维细胞。
[0026]本发明的有益效果在于：
[0027]本发明提供了猪特异性友好位点Pifs302,所述友好位点可用于外源基因的稳定 表达，不会因为受到表观遗传的修饰发生外源基因的沉默，解决转基因过程中外源基因表 达的不稳定以及位置效应的不可预知性等问题。本发明提供的猪特异性友好位点Pifs302， 使得对大家畜进行定点整合外源基因变得可靠，为大家畜的定点整合奠定了基础。本发明 针对猪特异性友好位点Pifs302提供的打靶载体可以高效特异的实现打靶。
【附图说明】
[0028]图1是本发明实施例5中所述同源重组载体的结构示意图。
[0029]图2是本发明实施例6中PCR法鉴定细胞单克隆，发生定点整合的会扩增出7kb的条 带，没有定点整合的只有3kb的条带。
[0030]图3是本发明实施例6中在友好位点处的外源基因表达。
【具体实施方式】
[0031]下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0032]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 其中：px330载体购于Addgene公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶购于大连TaKaRa 公司；引物合成及序列测定由上海生工和深圳华大完成;LongAmp Taq DNA聚合酶、QOTNA聚 合酶；Trizol Reagent购于康为世纪公司；反转录酶购于Promega公司；SYBR Green购于 Roche公司；质粒去内毒素大提试剂盒、基因组提取试剂盒购于QIAGEN公司；酶切、连接、回 收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。
[0035] 实施例1
[0036]实施例1用于说明本发明所述猪特异性友好位点。
[0037] 所述友好位点Pifs302在基因组上的位置为:第15号染色体上第137957233bp(NC_ 010457.4，基于猪基因组序列信息版本号38(^(^310.2,2011年9月）。
[0038]实施例2
[0039]实施例2用于说明特异性靶向本发明所述友好位点Pifs302的sgRNA，该sgRNA由SEQID No.l所示的DNA序列转录得到。
[0040] 实施例3
[00411实施例3用于说明针对本发明所述友好位点Pifs302的CRISPR-Cas9打靶载体。[0042] CRISPR_Cas9打靶载体的构建方法如下：
[0043] 1、构建打靶载体
[0044] 将SEQIDNo