转录因子cdxa调控鸡肠道内糖转运蛋白glut2表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及转录因子⑶XA调控鸡肠道 内糖转运蛋白GLUT2表达的方法。
【背景技术】
[0002] 饲料转化率是畜牧业衡量经济效益的重要指标，是由基础代谢、蛋白质沉积、消化 能力、食欲、行为等多种性状互作的结果，受遗传、环境、性别和营养组分比例等因素的影 响。有研究发现，通过控制饲料中各营养组分的比例可以在一定程度上调节畜禽的饲料转 化率，如增加饲料中能量、蛋白质比例会提高饲料转化率，但应该注意的是，此举同时也会 提尚伺养成本。
[0003] 在家禽养殖生产经营过程中，饲料成本占生产成本中比例很大，约为70%，所以，将 优质饲料尽可能转化为鸡的体增重或产蛋量，或者在不影响鸡产量的前提下，减少现有饲 料中某些营养成分的比例以减少饲喂浪费，在提高养殖业的经济效益方面起很重要的作 用。从长远眼光看，在分子水平上，利用遗传育种的方法是提高鸡饲料转化率的最终有效途 径。
[0004] 肠道是鸡消化吸收营养物质的最主要场所，肠道的发育情况直接影响其对饲料中 营养成分的吸收和利用，进而影响鸡的生长速率与饲料转化率。葡萄糖等糖类营养物质是 机体内主要的能源物质，也是生物体内细胞结构物质，具有重要的生物学功能。肠道对糖类 营养物质的吸收过程主要由糖营养转运蛋白完成，而糖营养转运蛋白基因的表达受多个转 录调控因子的调控。
[0005] 畜禽饲料转化率的高低直接影响生产的投入与回报，而营养物质中糖分的利用主 要源于肠粘膜上皮细胞中钠/葡萄糖转运载体（sodium/glucosecotransporter，SGLT)和 葡萄糖转运载体(glucosetransporter，GLUT)两类转运载体共同协作完成。其中SGLT家族 中SGLT1通过主动运输将肠道内葡萄糖吸收转运至上皮细胞中，GLUT5通过易化作用将果糖 吸收到细胞中，而位于肠上皮细胞基底的GLUT2蛋白主要负责将胞内的葡萄糖、果糖向组织 间隙液和血液中传送，三种糖转运蛋白相互协作完成机体对糖类物质的吸收。肠道糖运输 过程见图1。
[0006] GLUT家族中GLUT2是一种生物体内普遍存在的葡萄糖转运蛋白。由524个氨基酸组 成，蛋白质的二级结构由12个跨膜的α螺旋组成，GLUT2基因位于3号染色体，定位于3q26.1 ~q26.3,共有11个外显子。GLUT2是一个对葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖亲和力不高的转 运体，但对葡萄糖胺有较高的亲和力，且具有葡萄糖感受功能。有研究表明十二指肠同源框 蛋白（Pdxl)与神经分化因子(NeuroDl)能共同诱导与β细胞功能相关的Nkx6.1转录因子和 GLUT2的表达，而过表达的非结构5A蛋白（NS5A)能降低GLUT2的启动子活性，Yamamoto等用 链脲菌素诱导大鼠致糖尿病模型中发现，低胰岛素和高血糖水平能增加小肠和肝脏GLUT2 的表达，而在糖尿病小鼠胰腺中的GLUT2表达量显著下降，这表明除了葡萄糖和胰岛素外， 还有其他转录因子对GLUT2的表达有调节作用。Farrell等发现从各种草药、香料、种子等 组成的草药补充品中提取的多酚粗提液能够减少肠细胞系Caco-2中葡萄糖的转运，这一过 程通过与糖转运蛋白GLUT2的交互作用共同完成。Leturque等研究发现患有糖尿病的试验 小鼠体内肝脏和内分泌腺中GLUT2mRNA的表达量很高。Mace等研究发现糖转运蛋白GLUT2 调控K细胞和L细胞内肠肽的分泌，该肠肽能够感应营养物并为释放GIP、GLP-1和PYY等内分 泌素提供信号通路。Kellett等将试验小鼠小肠处于葡萄糖浓度不断升高的环境中，研究发 现，为了满足吸收高葡萄糖所需的能力，位于肠顶膜的糖转运蛋白GLUT2的浓度和内在活性 持续提高。这一现象由很多研究者利用小鼠、大鼠、肥胖病人等通过多个独立试验所证实。 Gu等以MIN6为研究模型发现，人参在肠道的中代谢化合物K通过上调糖转运蛋白GLUT2基因 的表达显著影响胰岛素分泌。因此，糖转运蛋白GLUT2在小肠糖吸收中的作用十分重要，但 在鸡的小肠中研究报道很少。
[0007]饲料中的碳水化合物只有在肠道被分解为单糖后才能被吸收，而且糖类在家禽体 内循环中的主要形式是葡萄糖、果糖、半乳糖。糖转运蛋白对糖类物质的吸收过程及其重 要。其中，葡萄糖易化转运载体GLUT2主要表达于肾脏和小肠吸收上皮基底部的上皮细胞 内，参与葡萄糖的吸收释放或重吸收过程，在肠上皮细胞和血浆葡萄糖浓度之间发挥平衡 作用。George等研究发现在一些情况下GLUT2可转运至肠上皮细胞的顶膜而调节肠道对葡 萄糖的吸收。Cheeseman认为位于基底膜的GLUT2同时转运葡萄糖和果糖，它是目前已知的 唯一的一个对葡萄糖和果糖都具有转运能力的糖转运蛋白。GLUT2介导的易化扩散机制既 能使细胞吸收增强也不会消耗多余能量。
[0008]同源盒基因（homeoboxgene)是在果绳的研究中发现的一类基因，对生物的器官 形成和细胞分化调控有着关键作用。在不同个体中其核酸序列中都含有一段180个碱基的 保守序列，编码60个氨基酸，构成一个多肽区域，因此称之为同源盒(homeobox)或同源结构 域(homeodomain)(同源盒基因在胃肠道发育与胃肠道肿瘤发生中有作用）。根据基因的序 列及分布区域的不同，同源盒基因可以分为两大家族:Η0Χ及PARAH0X家族，Η0Χ家族包含 Η0Χ-Α、B、C三个成员，PARAH0X则包含GSH、PDX和CDX。
[0009] CDX家族包括⑶X1、CDX2和⑶X4，CDX家族在小鼠发育时形态的形成过程中有重要 的作用。尾侧型同源基因CDX1是属于同源盒基因CDX家族的一个转录因子，禽类中称之为 CDXA，编码260个氨基酸，含有三个外显子和两个内含子，蛋白定位于细胞核，与其他同源盒 基因一样，⑶XA转录因子通过螺旋-转角-螺旋(He 1 i x-turn-he 1 iX)结构识别并结合在受调 控基因的5'调控区序列，对下游基因表达进行调控。有研究表明，通过同源重组对小鼠⑶XI 基因进行敲除，小鼠可以正常生长，但其颈椎发生了前移的异常现象。在小鼠胚胎直肠的形 成时期，⑶XA基因的异常表达可导致肛门直肠畸形(ARM)。现在国内外对⑶XA基因的研究主 要集中于胃癌与胃肠化生的预防和治疗中。文献报道，在正常胃黏膜中没有CDXA基因的表 达，而在胃肠化生型组织中有CDXA基因的检出，因此认为CDXA转录因子能促进上皮细胞的 分化成型。CDXA转录因子在鸡的消化道中特异表达于十二指肠至直肠，主要集中在小肠与 小肠隐窝，而在其他正常的消化道中不表达。其促进上皮细胞生长分化，在消化道内皮的脱 落补充过程中发挥重要的作用。在某些表达CDXA蛋白的报告基因表达系统中，含有CDXA元 件的载体能够增强基因的转录活性。CDXA作为转录调控因子，特异表达于消化道的小肠中， 其势必会对部分下游基因有调控作用。
[0010] 尾侧型同源基因⑶XA是属于同源盒基因⑶XA家族的一个转录因子，主要控制肠上 皮细胞的增殖与分化，并有研究发现CDXA转录因子过表达能促进葡萄糖-6-磷酸酶的表达。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的 方法。
[0012] 本发明由如下技术方案实现的：一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白 GLUT2表达的方法，包括构建转录因子⑶XA的真核表达载体pcDNA3.1-⑶XA，鸡小肠上皮细 胞体外分离培养及鉴定，运用阳离子脂质体介导法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细 胞，转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA，绝对PCR荧光定量测定cDNA中目的基因CDXA的 表达量与糖转运蛋白基因GLUT2的表达量。
[0013] 具体包括如下步骤： 1 ·构建真核表达载体pcDNA3 · 1-⑶XA: A. 引物设计:NCBI中查找鸡转录调控因子CDXA基因序列信息，按查到的基因序列应用 Primed. 0进行在线引物设计，在CDXA上下游引物的5'末端分别添加双限制性酶切位点 Hindlll和EcoRI;引物设计见表1，其中AAGCTT和GAATTC为添加的限制性内切酶位点； 表1引物
B. PCR扩增相应的基因片段：以鸡小肠总RNA反转录成的cDNA第一链为模板，采用设计 好的PCR引物扩增基因CDXA的相应片段； C. PCR产物的纯化回收、克隆与测序:按照北京全式金生物技术有限公司的割胶回收 试剂盒进行PCR产物的纯化回收，纯化得到的PCR产物连接转化，扩大培养的菌液进行测序， 测序正确的菌液进行质粒的提取，用微量核酸测定仪测定质粒的浓度和纯度； D. pcDNA3.1-CDXA的制备：用Hindm与EcoRI分别酶切CDXA质粒和pcDNA3.1质粒，回收 之后，将两者用T4DNA链接酶进行4°C过夜连接； E. 重组子的转化:所制备的pcDNA3.1-⑶XA连接产物加入到感受态大肠杆菌DH5a中， 在PCR仪中42°C90s热激反应，反应结束后将菌液中的菌体复苏;复苏后的菌体进行液体 扩大培养，然后将扩大培养的菌体测序； F. 质粒的提取:测序正确的菌液进行质粒提取;具体操作步骤参照Omega公司去内毒素 质粒提试剂盒。
[0014] 2.鸡小肠上皮细胞体外分离培养及鉴定：取15日龄鸡胚，无菌操作取出小肠，去 除肠系膜分离小肠并清洗干净小肠组织块;采用嗜热菌蛋白酶HEPES消化液进行酶消化组 织块，使其形成细胞玄烨，采用相差贴壁法培养鸡小肠上皮细胞，培养好鸡小肠上皮细胞接 种于细胞培养板，至于40°