用Alu基因的同源基因B1基因且无需DNA提取的检测血浆游离DNA的定量PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明旨在提供一种能反映大、小鼠过度训练情况的血浆游离DNA水平的定量PCR检测方法，该方法的扩增引物特别设计，只需一滴静脉血、无需DNA抽提、3小时就可检测出血浆游离DNA水平。若想数值能更准确，以及动态反应过度训练过程，可以选择训练前、训练后即刻以及训练后的不同时间采集静脉血，检测血浆游离DNA的水平，动态观察和比较。
【背景技术】
[0002]目前检测血浆游离DNA水平的方法有彗星检测或称为单细胞凝胶电泳试验、血浆DNA的荧光定量测定和定量PCR方法。第一种方法的长处是可检测单细胞水平的DNA损伤，但取材到的细胞不一定能反映血浆总的DNA损伤程度；第二种方法要进行血浆DNA的抽提之后才可进行，且敏感性不是很高，而第三种的定量PCR方法主要都是针对人的研究，缺乏对大、小鼠的相关研究。我们选用与人类基因中含量最丰富的Alu基因的同源基因B1基因，对扩增引物进行了设计，使其具有较高的特异性，所以无需再进行血浆DNA的抽提，可直接进行血浆游离DNA的定量PCR检测。由于PCR的扩增产物是模板以2的指数次方增加，所以只需少至20ml (约一滴静脉血)即可，血浆分离和PCR扩增在3小时内就可完成。
[0003]应用七大类生理指标(血睾酮水平、皮质醇水平，睾酮/皮质醇比值，晨脉，Hb水平，血尿素、血清肌酸激酶)的综合评定来反映是否出现过度训练及过度训练的程度，但这些指标均没有特异性、且常常滞后，不能早期、敏感、准确地反映过度训练情况。因此，体育界非常迫切地希望有某种分子能成为反映过度训练的早期、敏感监测指标，并且检测方法简便、快速、需血量少。这不仅对避免运动员出现由过度训练导致的运动性免疫抑制有重要作用，而且对建立过度训练的大、小鼠模型，从而进行过度训练及运动性免疫机制的深入研究也发挥不可替代的作用。近年来的研究显示，血浆游离DNA的水平是一个很好的候选分子。自1982年首次报道了运动通过增多的自由基损伤组织，引起DNA断裂，使血中出现游离 DNA (cell free DNA) (Davies KJ, Quintanilha AT, Brooks GA, et al.Freeradicals and tissue damage produced by exercise.B1chemB1phys Res Commun.1982; 107 (4):1198-205.运动产生的自由基和组织损伤。生物化学和生物物理研究通讯。)之后，近几年来关于运动对血浆游离DNA的影响及意义越来越受到研究者的关注。目前的研究认为不论是一次的大强度训练(1.Atamaniuk J, Vidotto C, Tschan H, et al.1ncreased concentrat1ns of cell-free plasma DNA after exhaustive exercise.Clin Chem.2004; 50 (9): 1668-70.力竭运动后血浆游离DNA的浓度增加。临床化学。
2.Atamaniuk J, Stuhlmeier KM, Vidotto C, et al.Effects of ultra-marathonon circulating DNA and mRNA express1n of pro- and anti—apoptotic genes inmononuclear cells.Eur J Appl Phys1l.2008; 104(4):711—7.马拉松对单核细胞促凋亡和抗凋亡的游离DNA和mRNA的影响。欧洲应用生理学杂志。3.Beiter Tl, Fragasso A,HudemannJ，et al.Short-term treadmill running as a model for studying cell-freeDNA kinetics in viv0.Clin Chem.2011; 57 (4):633-636.短期的跑台跑步运动是一个研究体内游离DNA动态变化的模型。临床化学。4.Velders Ml, Treff Gl，Machus Kl，et al.Exercise is a potent stimulus for enhancing circulating DNase activity.ClinB1chem.2014:47(6):471-474.运动是一个增强循环DNA酶活性的潜在刺激因素。临床生化。5.Atamaniuk J，Vidotto C，Kinzlbauer M，et al.Cell-free plasma DNAand purine nucleotide degradat1n markers following weightlifting exercise.Eur J Appl Phys1l.2010; 110(4):695-701.举重后的血浆游离DNA和嘌呤核苷酸降解标记物。欧洲应用生理学杂志。)，还是持续一段时间(慢性)的大强度或大负荷训练(1.Fatouros IG，Destouni A，Margonis K，et al.Cell-free plasma DNA as a novelmarker of aseptic inflammat1n severity related to exercise overtraining.ClinChem.2006;52(9):1820-4.血浆游离DNA是一个与过度训练有关的反映无菌性炎症严重程度的新标记。运动医学。2.Breitbach Sl，Tug S，Simon P.Circulating cell-freeDNA: an up-coming molecular marker in exercise phys1logy.Sports Med.2012;42(7):565-86.循环中的游离DNA:—个将来的运动生理学的分子标记。运动医学。)，都可使血浆游离DNA的水平迅速(多在运动后的数分钟到一、二小时内)升高，且增加幅度明显(从几倍到几十、上百倍不等)。如果是单次的大强度运动则血浆游离DNA清除较快，通常在12小时内恢复正常，而慢性的大强度和大负荷运动则升高的游离DNA水平维持较久，从1天到十来天不等，由运动强度和负荷决定(1.Fatouros IG，Destouni A，Margonis K，et al.Cell-free plasma DNA as a novel marker of aseptic inflammat1n severityrelated to exercise overtraining.Clin Chem.2006; 52 (9): 1820-4.血楽游离 DNA 是一个与过度训练有关的反映无菌性炎症严重程度的新标记。运动医学。2.Breitbach S1，Tug S， Simon P.Circulating cell-free DNA: an up-coming molecular marker inexercise phys1logy.Sports Med.2012; 42 (7): 565-86.循环中的游离DNA:—个将来的运动生理学的分子标记。运动医学。)。已发现多种运动方式，如马拉松、举重等抗阻或耐力的力竭运动会使血浆游离DNA水平增加。且血中游离DNA的水平与过度运动所致的无菌性炎症的严重程度或运动强度成正比。所以，血浆游离DNA水平被认为是现在最有希望成为反映过度训练的指标。
[0004] 检测血浆游离DNA水平的方法，目前除了有单细胞凝胶电泳试验(Zancan M，Galdi F， Di Tonno F， et al.Evaluat1n of cell-free DNA in urine as a markerfor bladder cancer diagnosis.1nt J B1l Markers.2009; 24 (3): 147-55.尿中游离DNA作为膀胱癌诊断标记的评估。国际生物标记杂志。)、血浆DNA的荧光定量测定(ZancanM，Galdi F，Di Tonno F，et al.Evaluat1n of cell-free DNA in urine as a markerfor bladder cancer diagnosis.1nt J B1l Markers.2009; 24 (3): 147-55.尿中游离DNA作为膀胱癌诊断标记的评估。国际生物标记杂志。)之外，还有定量PCR方法(BreitbachSl， Sterzing Bl， Magallanes Cl, et al.Direct measurement of cell-free DNA fromserially collected capillary plasma during incremental exercise.J ApplPhys1l(1985).2014;117(2):119-30.递增运动中系列收集