一种检测戈谢病gba基因突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于试剂盒领域，特别涉及一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒及其检 测方法。
【背景技术】
[0002] 戈谢病(GaucherdiseaSe，GD)是溶酶体糖脂贮积症中最常见、发病率最高的一 种，为常染色体隐性遗传，最早由法国医生Gaucher报道。GBA基因编码葡糖脑苷脂酶，位于 lq21染色体上。GD是由GBA基因变异，造成溶酶体中的酸性β-葡糖苷又称葡糖脑苷脂 (Glucocerebrosidase，GC)无法正常水解为神经酰胺，因而释放的β-葡萄糖脑苷脂被网状 内皮系统(脾、肝、骨髓)的巨噬细胞吞入并贮存于其溶酶体中形成典型的戈谢细胞，正常的 骨髓基质被特征性戈谢细胞(电镜下可见胞浆中有特异的管状脑苷脂包涵体)取代，导致细 胞失去原有的功能，引起肝脾逐渐增大等一系列症状。
[0003] GD属于罕见疾病，在世界各地广泛流行，发病率为1/(10-40)万，在我国发病率为 1/(20-50)万。任何年龄自出生至80岁均可发病，自1948年首次报道以来，各地均有病例发 生。临床上根据神经系统病变的严重程度将⑶分为三类：1型为最普遍的发病形式，在成人 中发现较多，不涉及神经系统病变，I型GD进展缓慢，脾切除后可长期存活，智力正常，惟生 长发育落后。Π和m型主要在婴幼儿和青少年中发病，涉及神经系统病变。Π型GD多于发病 后1年内死于继发感染，少数可存活2年以上。ΙΠ型GD多由于神经系统症状较重，常死于病发 症。
[0004] 目前DNA技术可诊断定位于人类染色体1q21的GBA基因，基因长度为7.6kb，含有11 个外显子，在此基因的下游16kb处有一高度同源的假基因。目前鉴定的致病突变位点大约 有300多个，常见的是N370S(c.l226A>G)和L444P(c.I448T>C)两种突变。近来国外学者对⑶ 的基因型研究已确定了 42种突变，包括错义突变、剪接突变、移码突变、缺失、基因与假基因 融合与基因转化等。其中最常见的错义突变导致合成的GC催化功能及稳定性降低。目前已 经发现一些基因型与表现型存在相关性，例如N370S等位基因多与I型⑶患者相关;L444P等 位基因多与神经型相关，L444P纯合子多表现为ΙΠ型，而L444P与其他基因结合时通常表现 为Π型。其他基因型如F213I、D409H、G202R可能与⑶神经系统损害表型有密切相关性。但是 现在还很难将临床病征确切的归因于某一种基因型。
[0005]虽然⑶的基因型-表现型的相关性十分复杂，但是一些基因型与患者症状有关。通 过对GBA基因的检测，有助于诊断GD。Sanger测序法是目前公认的，是大多数临床分子诊断 项目的金标准，特异性甚至能达到100%，是分子诊断方面的经典技术平台。因此采用 Sanger测序法对GBA序列进行突变检测，具有稳定性高，特异性好的优点，能够有效避免假 阳性的产生。
[0006]为了给Sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目的特点，建立一个稳定 可靠的PCR体系。该项目PCR部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液基 因组DNA。由于临床标本物流运输中存在众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质量 优良的全血标本，因此获得的DNA质量也会存在较大的样本间差异。2.由于需检测的外显子 数目较多，即PCR目的片段过多，导致PCR条件不统一。
[0007] 溶解温度(Tm)是PCR中一个很重要的参数，是50%的引物和互补序列表现为双链 DNA分子时的温度，对于PCR的设定退火温度是必须的，合适的退火温度能够有效的减少非 特异性结合，还能保证目的序列有效退火。所以只有在保证特异性的情况下，设计引物的Tm 值尽量接近，使PCR的退火温度保持一致，从而达到PCR条件的统一。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒及其检 测方法，该试剂盒可用于检测GBA基因的突变位点，特异性好，灵敏度高。
[0009]本发明的一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增反应试 剂以及用于样本DNA中GBA基因扩增的PCR引物;其中，PCR引物如下：
[0022] 所述PCR扩增反应试剂包括Go:Taq?DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液。
[0023]本发明的一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0024] (1)采集待测血液样本，提取DNA;
[0025] (2)以该DNA为模板，采用用于样本DNA中GBA基因扩增的PCR引物进行PCR扩增，得 至IJPCR反应产物，进行测序分析，确定是否存在碱基突变。
[0026]所述步骤（2)中的PCR反应条件为：95°C5min; 95°C30s、62°C30s、72°C40s，15个循 环；95°C30s，55°C30s，72°C40s，25 个循环；最后 72°C10min。
[0027]所述步骤(2)中的PCR反应体系为:PCR扩增反应试剂10yL，ddH20 6yL，上下游引物 各lyL，样品DNA2yL。
[0028]有益效果
[0029]本发明可用于检测与戈谢病相关的基因突变位点，特异性好，灵敏度高;可用于临 床作为戈谢病早期发现、早期明确诊断的辅助性指标，降低误诊率和避免延误治疗;家系成 员进行筛查可明确发病风险，产前筛查并进行干预，可降低后代戈谢病的发病率，使用方法 简单，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0030] 图1是GBAexon6W814R突变型(A)与野生型(B)基因的测序峰图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0032] 实施例1
[0033] 1.样本抽提
[0034] (1)抽取200yL的全血，加入20yL蛋白酶K溶液，混匀。
[0035] (2)加入200yL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56°C放置10分钟，其间颠倒混匀数次，溶 液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0036] (3)加入200yL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去 除管盖内壁的水珠。
[0037] (4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 [0038] (5)向吸附柱CB3中加入500yL缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0039] (6)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0040] (7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000rpm(l3400Xg)离心30秒，倒掉废 液。
[0041 ] (8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400Xg)离心2分钟，倒掉