一种braf v600e基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
【技术领域】
[00011本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种BRAFV600E基因的检测引物组、其 构成的反应体系及应用。
【背景技术】
[0002] BRAF全称为鼠肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，是RAF家族的成员之一，定位于人染 色体7q34,是一种原癌基因，其编码产物是一个94KDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(B-raf)。 B-raf主要存在于睾丸组织和神经组织，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路中重要的转导因子， 参与调控细胞生长、分化和调往等重要的细胞事件。B-raf由783个氨基酸残基组成，其功能 的活化依赖于特点位点的氨基酸残基的磷酸化，其中位于CR3区的T598和S601的磷酸化对 于B-raf蛋白的激活至关重要，只有当这两个位点均磷酸化后，B-raf才能被完全激活。在多 种人类的恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌及肝癌中，均存在不同比 例的81^?突变，其中尤以￥60(^((：.17991'^)突变最为常见，约占所有突变比例的86%。 V600E突变能够模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使B-raf处于持续活化的状态。由 于B-raf是位于K-ras下游级联信号通路上的一个重要蛋白，因此当B-raf发生突变后，其编 码产物无需接受K-ras的活化信号便处于激活状态，使得EGFR抑制剂西妥昔单抗和帕尼单 抗的治疗效果减弱甚至无效。同时，一种威罗菲尼已被Π)Α批准用于治疗V600E突变阳性的 不可手术的转移性黑色素瘤患者。由于肿瘤存在异质性，而且取样标本中往往混入大量的 正常组织，再加上石蜡标本提取的基因组DNA质量有限，因此可能会导致检测结果可的假阴 性。目前用于检测BRAF基因突变的方法主要有Sanger测序法、焦磷酸测序法和荧光定量PCR 法，它们的灵敏度依次升高。测序法耗时长，操作繁琐，灵敏度低，且依赖非常昂贵的进口设 备，不易于大规模推广;荧光定量PCR法灵敏度较好，但同样依赖昂贵的检测设备和探针，因 此检测费用一直居高不下，然而患者的检测又势在必行，因此亟需我们开发一种既快速灵 敏又成本低廉的检测方法。
[0003]环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术， 其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶（BstDNA polymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生109-101()数量级的产物。具有 敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。
【发明内容】
[0004]本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种BRAFV600E基因的检测引物组、其构 成的反应体系及应用，所述检测体系具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。
[0005]为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
[0006]第一方面，本发明提供一种BRAF基因的检测引物组，其特征在于，所述检测引物组 如下：
[0007]正向外侧引物F3:SEQIDN0:1;
[0008] 反向外侧引物B3:SEQIDN0:2;
[0009] 正向内侧引物FIP:SEQIDN0:3;
[0010]反向内侧引物BIP:SEQIDN0:4。
[0011] 所述检测引物组的核苷酸序列如下：
[0012] 正向外侧引物F3:SEQIDN0:1:TGCTCTGATAGGAAAATGAGA;
[0013]反向外侧引物B3:SEQIDN0:2:GGCCAAAAATTTAATCAGTGG;
[0014]正向内侦J弓I物 FIP:SEQIDN 0 : 3 ： CTATGTAGCTAGACCAAAATCACCTGTTTTCCTTTACTTACTACACCT；
[0015] 反向内侧引物 BIP:SEQIDN 0 : 4 ： AATCTCGATGGAGTGGGTCCAAAATAGCCTCAATTCTTACCAT〇
[0016]本发明中，外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引物记为正向 内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了Flc和F2，BIP包含了Blc和B2,上述引物均 由在线软件PrimerExplorerV4设计。本发明在普通LAMP的基础上，以特异性要求最严格的 Flc的5'端引入特异引物，为进一步加强引物的特异性，通过在Flc的5'端第三位引进额外 突变，进一步降低非特异性扩增的可能性。
[0017] 优选地，所述SEQIDN0:3所示的序列是用于检测BRAFV600E突变的特异性引物。
[0018]第二方面，本发明提供一种检测BRAF基因的反应体系，所述反应体系包括权利要 求1或2所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱，BstDNA聚合酶，待检样品 基因组DNA和去离子水。
[0019]优选地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0020]优选地，所述Tris-HCl的浓度为 10-30mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、13mM、 15禮、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，优选为15-251111，进一步优选为 20mM〇
[0021 ]优选地，所述KC1 的浓度为 10-60mM，例如可以是 1OmM、1ImM、12mM、15mM、18mM、 20禮、231111、25111]\1、3〇111]\1、351111、4〇1111、451111、5〇1111、51111]\1、52111]\1、531111、541111、551111或6〇1111，优选为 50-55mM，进一步优选为50mM。
[0022] 优选地，所述(NH4)2S〇4的浓度为 5-13mM，例如可以是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、1OmM、 1ImM、12mM或13mM，优选为8-12mM，进一步优选为10mM〇
[0023]优选地，所述MgS〇4 的浓度为 2-8mM，例如可以是 2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mMS8mM， 优选为2_6mM，进一步优选为4mM。
[0024] 优选地，所述Tween-20的体积分数为0 · 1-1 %，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、 0·4%、0·5%、0·6%、0·7%、0·8%、0·9%或1%，优选为0.1%。
[0025] 优选地，所述dNTPs的浓度为 1 -2mM，例如可以是ImM、1.ImM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、 1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM，优选为 1.2-1.8mM，进一步优选为 1.4mM。
[0026] 优选地，所述羟基萘酚蓝的浓度为108-130μΜ，例如可以是108μΜ、109μΜ、110μΜ、 111卩]?、1124]\1、1154]\1、1164]\1、1184]\1、12(^]\1、1224]\1、1254]\1、1264]\1、1284]\1或13(^]\1，优选为115-123μΜ，进一步优选为120μΜ。
[0027] 优选地，所述甜菜碱的浓度为0.1-1.21，例如可以是0.謂、0.21、0.4]?、0.61、0.81 或1M，优选为0.5-1M，进一步优选为1M。
[0028]优选地，所述反应体系中每25yL反应体系含有以下组分：
[0031] 去离子水加至25yL。
[0032]第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的反应体系的使用方法，所述方法包 括如下步骤：
[0033]将反应体系所需各组分混合完毕，放置于恒温水浴锅进行反应，反应后升温进行 灭活处理，再根据体系颜色变化判定结果。
[0034] 优选地，所述恒温水浴锅的温度为55-70°C，例如可以是55°C、56°C、57°C、58°C、59 °(3、60°(3、61°(3、62°(3、63°(3、64°(3、65°(3、68°(3、69°(3或70°(3，优选为60-68°(3，进一步优选为63 V。
[0035] 优选地，所述反应时间为15_90min，例如可以是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85mir^90min，tfci￡ 为45_80min，进一步优选为60min。
[0036] 优选地，所述升温后的温度为78-90°C，例如可以是78°C、79°C、80°C、81°C、82°C、 83°(3、84°(3、85°(3、86°(3、87°(3、88°(3、89°(3或90°(3，优选为80-85°(3，进一步优选为80°(3。
[0037]优选地，所述升温后的反应时间为15_30min，例如可以是15min、16min、17min、 18min、19min、20min、22min、25min、26min、28mir^30mind;i^*18-26min，?-步优选为 20min〇
[0038]优选地，所述根据体系颜色变化判定结果为：
[0039]反应体系为紫罗兰，则待测样本不携带BRAF V600E突变；
[0040] 反应体系为天蓝色，则待测样本携带BRAF V600E突变。
[0041]第四方面，本发明还提供一种检测BRAF基因的检测试剂盒，所述试剂盒包含如第 二方面所述的反应体系。
[0042]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0043] (1)步骤简单:扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩 增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等 变温过程；
[0044] (2)高特异性:扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与 否，可应用于检测BRAF突变型等位基因，会给西妥昔单抗和帕尼单抗以及威罗菲尼的正确 使用带来更可靠的保障；
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