一种dpyd*9a基因多态性的引物及其检测方法
【技术领域】
[00011本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种DPYD*9A基因多态性的引物及其检 测方法。
【背景技术】
[0002]二氢啼啶脱氢酶（dihydropyrimidinedehydrogenase，DPD)编码基因是位于 1 号 人类染色体的短臂上（lq22)，基因全长约150kb，含有3kb的编码序列，其由23个外显子构 成，长度从69bp到1404bp，基因中内含子由长短不等的序列组成。二氢嘧啶脱氢酶是作用于 5-FU药物代谢途径的关键酶之一，是分解代谢的限速酶，其含量的高低决定了5-FU药物的 代谢速度，进而影响体内药物的毒性和疗效。
[0003] 5-Fu及其前体药物卡培他滨广泛用于肿瘤化疗，80%以上的5-Fu及其前体药物是 通过DH)代谢降解为无活性代谢物二氢氟尿嘧啶(FUH2)而失活。不同个体间DPD酶活性存在 明显差别，导致药物清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应存在明显的个体差异性。
[0004] DPYD突变会影响DPD酶活性的改变，中国北方人群的研究发现DPYD*9(外显子2， T85C)的突变频率较高（11.25%)。因此，检测DPYD基因多态性可以对肿瘤患者进行药物敏感 指导，提高治疗效果，降低药物的毒副作用。
[0005] 中国专利CN102146440B公开了一种甄别DPYD基因*9A突变位点的PCR检测试剂盒， 所述试剂盒主要包括特异性引物、EvaGreen荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶。该实时荧光PCR检测方法可以实现二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点快速、准 确、特异分析。但是，但其高居不下的假阳性率为实际应用所诟病，而且该检测方法还存在 检测通量少，每次只能检测一种突变类型的缺陷，不能满足实际应用的需要。
[0006] 中国专利CN102952866B公开了一种DPYD基因多态性检测特异性引物和液相芯片， 该液相芯片包括野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由5 '端的tag序列和3 '端针对目 的基因多态性位点的特异性引物序列组成。该液相芯片可用于并行或单项检测DPYD基因三 种常见基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突变型。但是，上述检测方法操作复杂，不利 于大规模的推广和应用。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种DPYD*9A基因多态性的引物及 其检测方法，该引物主要用于检测DPYD基因的DPYD*9A(c. 85T>C)位点，具有特异性强、检测 灵敏度高、准确性好等优点，为DPYD*9A基因多态性提供了 一种简单有效的检测方法。
[0008] 本发明提供了一种DPYD*9A基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR 引物;所述PCR扩增引物为：针对DPYD*9A的上游引物5 ' -CTGTCTTTAGAGTATCCTGGCTTT-3 ' (SEQIDN0·1)和下游引物5'-CTTACAATGTGTGGAGTGAGGTA-3'（SEQIDN0·2);所述 SNaPshotPCR弓| 物为：针对DPYD*9A的SNaPshotPCR弓|物5'_ TTTTTTTTTTTTTTTTTTAACACAAACTCATGCAACTCTG_ 3，(SEQI〇N〇_3)o
[0009]另外，本发明还提供了一种DPYD*9A基因多态性的检测方法，包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物 进行SNaPshotPCR扩增，并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0010]进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
[0011] 进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C3min;阶段2: 98°C10s;阶段3:58°C30s;阶段4:72°Clmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保温。
[0012]进一步地，所述步骤S3中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C10s;阶 段2:55°C5s;阶段3:60°C30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保温。
[0013]进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0014 ]除此之外，本发明提供的所述的DPYD*9A基因多态性的引物在制备检测DPYD*9A基 因多态性试剂中的用途。
[0015]与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势:本发明提供的DPYD*9A基 因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了DPYD*9A基因 多态性的检测，可以对肿瘤患者进行有效的药物敏感指导，提高药物的清除率、肿瘤的反应 性及患者的毒性反应，为实现肿瘤患者个体化治疗提供了依据，更有利于肿瘤患者的康复。
【附图说明】
[0016]图1为本发明提供的DPYD*9A基因引物的扩增片段； 图2为本发明提供的DPYD*9A基因引物扩增产物的部分测序图； 图3为本发明提供的DPYD*9A基因SNaPshotPCR引物的检测结果图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0018]实施例一、引物 本发明提供的DPYD*9A基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物，所 述PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC 数据库比对，无已知SNP位点。
[0019]表1本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下： 1)DPYD*9A基因特异引物于UCSC中进行Blast，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检 测位点，无其它同源基因，DPYD*9A基因扩增片段位于chrl: 98348761-98348940,长度为 180bp，扩增序列图如图1。
[0020] 2)使用表1中PCR扩增引物分别对检测样本进行扩增及Sanger测序，测序结果如图 2所不，各引物扩增序列与DPYD*9A基因参考序列吻合。
[0021] 3)使用表1中