Egfr抗体缀合物的制作方法
【专利说明】EGFR抗体缀合物 发明领域
[0001]本发明涉及一种免疫缀合物，其靶向表达EGFR的癌细胞群体并包括与微管损伤剂 诸如美登素类(maytansinoid)缀合的抗EGFR抗体，诸如帕尼单抗(panitumumab)或西妥昔 单抗（cetuximab) 〇
[0002] 发明背景
[0003] 细胞结合蛋白（诸如抗体)与有效的细胞杀伤剂的缀合增强它们的抗癌活性，并提 供所谓的"魔术子弹(magic bullets)"，具有混合的临床结果。
[0004] 相对于裸露抗体，免疫缀合物通常显示增强的细胞杀伤功效，这增加它们抗击表 达抗体靶向抗原的癌细胞的活性。但是，在表达相同抗原的正常细胞中也观察到功效的相 同增加。特别关注的是增加的抗快速增殖组织(诸如皮肤)的细胞毒性。例如，由美登素类和 CD44v6抗体组成的CD44v6靶向免疫缀合物非常活跃的抗击癌细胞，但因为严重的皮肤毒性 (诸如毒性表皮坏死溶解，其作为增强免疫缀合物抗击也表达CD44v6的皮肤细胞的活性的 结果而发生（Tijinket al. ,Clin Cancer Res,2006,12:6064))而被中止。
[0005] 另一种细胞表面蛋白，表皮生长因子受体或EGFR，是开发抗癌免疫缀合物的有吸 引力的靶标，因为许多肿瘤表达该抗原及其快速的内化。但是，因为皮肤组织也表达EGFR， EGFR靶向药剂，诸如抗体西妥昔单抗和帕尼单抗，也显示皮肤毒性水平，这或者要求剂量降 低或者在一些情况下是如此严重导致治疗的中止。
[0006] 通过免疫缀合物，这些抗体的毒性利用缀合有效的细胞毒素得到扩大。这加剧了 对正常细胞已经具有固有毒性的抗体的问题。例如，当通过CD44v6抗体递送时，与毒性美登 素类的缀合造成严重的针对皮肤细胞的毒性。因此由于对这类免疫缀合物增强的皮肤毒性 的顾虑，还没有进行基于批准的抗EGFR抗体的抗EGFR免疫缀合物的开发。正在使用其他策 略来开发抗EGFR免疫缀合物。
[0007] 现在正在设计抗EGFR免疫缀合物来专门解决这些安全性顾虑。这些缀合物基于针 对EGFR的突变但天然存在的形式(称为EGFRvIII)或EGFR的构象形式的抗体，这两种都在肿 瘤细胞而非皮肤细胞上占优势（分别见US7628986和US 7589180)。例如，抗EGFR抗体MAb806 是革El向只在癌细胞上发现的EGFR表位的抗体，有可能提供超过现有EGFR抗体的优点，这些 现有EGFR抗体对正常器官诸如人的皮肤都显示显著的结合。关于这种特异性，应该意识到 "与现有EGFR抗体相比MAb 806最重要的优点是MAb 806可以直接缀合到细胞毒性剂"，该方 法不适用于其他EGFR抗体，因为"细胞毒性缀合几乎是必然诱导严重的毒性"（US 7589180)。包括与抗微管负载连接的EGFR MAb 806的免疫缀合物目前正处于晚期实体瘤患 者的临床I期试验中。
[0008] 还在尝试筛选裸露抗EGFR抗体及其免疫缀合物，以鉴定具有抗EGFR的部分拮抗活 性和降低的抗角质形成细胞活性的那些抗体(参见US2012/0156217)，基于"掩蔽"的抗EGFR 抗体(其优先在肿瘤微环境中活化）的免疫偶联物(W0 2009/025846)，和基于中等亲和力的 抗体(其优先在肿瘤而非正常组织中积聚）的免疫缀合物(W0 2012/100346)。所有这些策略 的目的在于降低针对皮肤和表达EGFR的其他器官的毒性，因为目前批准的抗EGFR抗体被认 为不适合开发成免疫缀合物。
[0009] 本发明的目的是提供一种用于治疗EGFR+疾病细胞包括EGFR+癌细胞和包括它们 的肿瘤的免疫缀合物。本发明的另一个目的是提供一种选择性增强EGFR抗体针对疾病细胞 的细胞毒性的方法。通过这种方法，基本上避免了针对正常细胞的毒性的增强。
[0010] 发明概述
[0011]本发明源自以下预料不到的最初发现:抗EGFR抗体西妥昔单抗与毒性美登素类通 过不可切割的接头的缀合产生一种免疫缀合物，其显示增强的抗癌细胞的细胞毒性而抗皮 肤细胞的细胞毒性没有相应增加。本发明人证明，一些抗EGFR抗体针对癌症和角质形成细 胞的活性通过连接美登素类和其他细胞杀伤剂而显著增强，但是美登素类缀合的西妥昔单 抗的活性只针对癌细胞但不针对角质形成细胞增强。在这些研究中发现，与预期一致，西妥 昔单抗与除抗微管毒素以外的细胞杀伤剂(诸如皂草素）的缀合具有伴随的和显著增强的 针对角质形成细胞的毒性。
[0012] 还证明另一种具有针对EGFR的完全拮抗物活性的抗体，即帕尼单抗，当与抗微管 负载诸如美登素类缀合时，也显示针对EGFR+细胞的选择性增强，显示对EGFR+癌细胞的毒 性而不影响EGFR+正常细胞诸如角质形成细胞。
[0013] 基于本发明公开的这些和其他发现，本发明能够筛选产生免疫缀合物必需的组 分，所述免疫缀合物包括EGFR抗体和毒性负载，所述毒性负载增强针对癌细胞但不针对正 常细胞诸如角质形成细胞的抗体活性。具有所述特性的免疫缀合物要求筛选作为完全拮抗 物的EGFR抗体，作为抗微管物质的毒素，和最优选不可切割的接头。通过使用这些标准，提 供一种基于EGFR抗体的免疫缀合物，其具有显著的抗EGFR+癌细胞的治疗活性，但抗EGFR+ 正常细胞包括皮肤细胞诸如角质形成细胞的毒性没有相应增加。缺乏抗皮肤细胞的毒性的 额外增强是至关重要的，因为裸露EGFR靶向抗体的特征在于高发生率的皮肤毒性，不增强 这些副作用是有益的。
[0014] 因此，在一个一般方面，提供一种免疫缀合物，包括具有对EGFR的完全拮抗物活性 的抗体和与其通过不可切割接头缀合的毒素，所述免疫缀合物相对于裸露形式的抗体具有 对EGFR+角质形成细胞基本上未增强的细胞毒性作用。所述免疫缀合物对EGFR+癌细胞的细 胞毒性作用期望是增强的。毒性负载期望是抗微管毒素。
[0015] 在另一个一般方面，提供一种用于增强EGFR抗体的抗癌活性但不增强其对正常 EGFR+细胞的作用的方法，所述方法包括：
[0016] (i)选择用于缀合EGFR抗体，所述抗体是完全EGFR拮抗物并与西妥昔单抗竞争结 合EGFR;
[0017] (i i)选择通过EGFR抗体递送的抗微管毒素；
[0018] (iii)选择用于偶联所选EGFR抗体和抗微管毒素的接头;和
[0019] 产生一种免疫缀合物，其在抗体和毒素之间掺入接头，从而提供具有细胞毒性的 免疫缀合物，所述细胞毒性针对EGFR+疾病细胞增强，但针对正常EGFR+角质形成细胞基本 上不增强。
[0020] 在一个具体方面，提供一种包括西妥昔单抗和与其缀合的毒素的免疫缀合物，所 述免疫缀合物相对于裸露西妥昔单抗具有细胞毒性作用，所述细胞毒性作用（1)针对EGFR+ 癌细胞增强，和（2)针对EGFR+角质形成细胞基本上未增强，其中所述免疫缀合物包括西妥 昔单抗和通过不可切割接头缀合的抗微管毒素诸如美登素类DM-I。在选择性实施方案中， 西妥昔单抗是西妥昔单抗的等同物，诸如西妥昔单抗的EGFR结合片段，或西妥昔单抗的 EGFR结合变体，其在抗体恒定区或框架区掺入1个或2个或更多个良性取代，但不影响抗体 与受体的结合或抗体缀合介导的细胞杀伤。例如，可以使用标准方法将嵌合的西妥昔单抗 进一步人源化以产生更像人形式的抗体。可选的，通过对人Fab文库筛选可以结合并强烈抑 制EGFR和与西妥昔单抗竞争受体结合的抗体，开发出完整的人抗EGFR抗体，诸如 necitumumab，也称为IMC-11F8,其被认为与西妥昔单抗功能等效（Li S. ,Kussie P·， Fergusson KM，Structural basis for EGF receptor inhibition by the therapeutic antibody nC-llF8.Structure.2008 Feb;16(2):216-27)〇
[0021]在另一个具体方面，提供另一种包括帕尼单抗和与其缀合的毒素的免疫缀合物， 所述免疫缀合物相对于裸露帕尼单抗具有细胞毒性作用，所述细胞毒性作用（1)针对EGFR+ 癌细胞增强，和（2)针对EGFR+角质形成细胞基本上不改变，其中所述免疫缀合物包括帕尼 单抗和通过不可切割接头缀合的抗微管毒素诸如美登素类DM-I。在选择性实施方案中，帕 尼单抗是帕尼单抗的EGFR结合片段，或是帕尼单抗的变体，其掺入1个、2个或更多个良性取 代但仍维持帕尼单抗母体的EGFR结合和抑制特征。
[0022]在优选的实施方案中，使用不可切割接头实现抗体与毒素的缀合。利用不可切割 接头，通过溶酶体对药物缀合物的胞内破坏实现细胞毒性负载的释放。不可切割的接头基 本上耐受酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割或二硫键切割， 而可切割接头(其可选择地使用但较不优选)是可以被上述切割剂中的一种或更多种切割 的接头。这类不可切割接头的实例包括是或衍生自基于卤代乙酰基(haloacetyl)部分的那 些接头，选自N-琥珀酰亚胺-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯（SI AB )，碘乙酸N-羟基琥珀酰 亚胺酯（SIA)，溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SBA)，和N-琥珀酰亚胺基3-[溴代乙酰基氨基] 丙酸酯(SBAP)。可选的，不可切割接头是或衍生自基于马来酰亚胺基的部分，选自N-琥珀酰 亚胺基4_(马来酰亚胺甲基）环己烷羧酸酯（SMCC)，N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲 基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯）（LC-SMCC)，κ-马来酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺酯 (KMUA)，γ -马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)，ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰 亚胺酯(EMCS)，m-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，Ν-(α-马来酰亚胺乙酸)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)，琥珀酰亚胺-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基）己酸酯(SMPH)，Ν-琥珀酰亚 胺基4-(ρ_马来酰亚胺苯基)_丁酸酯(SMPB)，和Ν-(ρ-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI);另 一种不可切割的接头是马来酰亚胺己酰。（更多细节参见US 2005/0169933; ,Yoshitake et al,101 Eur.J.Biochem.395-399(1979)；Hashida et al,J.Applied Biochem.56-63 (1984);和Liu et al,18 690-697(1979)，和Doronina et al,.Bioconjugate Chem.,2006 Jan-Feb;17(1):114-24)。
[0023]在一个优选的实施方案中，使用不可切割的交联剂作为接头诸如琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)_环己烷-1-羧酸酯（SMCC)实现缀合。不可切割接头的其他有用形式包 括N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯（SIA)，硫代-SMCC，m-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯 (MBS)，硫代-MBS和琥珀酰亚胺基-碘乙酸酯，如文献所述，其引入1-10个反应基团。（参见， Yoshitake et al,101 Eur.J.Biochem.395-399(1979)；Hashida et al,J.Applied Biochem. 56-63(1984);和 Liu et al, 18 690-697(1979))。尤其可用于连接作为抗微管毒 素的奥里斯他汀（auristatin)的是Doronina等人（Bioconjugate Chem.，2006Jan_Feb; 17 (I) :114-24))描述的不可切割的马来酰亚胺己酰接头。
[0024]在另一个方面，提供一种药物组合物，包括对EGFR+癌细胞具有细胞毒性量的所述 基于EGFR抗体的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。
[0025]在另一个方面，提供所述药物组合物用于治疗EGFR+癌细胞的用途