呼吸道合胞病毒半活疫苗的制作方法
【专利说明】呼吸道合胞病毒半活疫苗 发明领域
[0001] 本发明涉及呼吸道合胞病毒(RSV)半活疫苗，其包含表达嵌合RSV/SeV F蛋白的基 因组复制缺陷型仙台病毒(SeV)载体。此外，本发明涉及用于产生本发明的基因组复制缺陷 型SeV载体的方法，及其在RSV感染和RSV感染相关疾病的治疗中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 现今使用的许多病毒疫苗(包括麻疹疫苗和一些流感疫苗)基于减毒病毒，并产生 良好和长效的预防性体液和细胞免疫应答(Amanna等人，N. Engl. J.Med. 357:1903-1915， 2007)。这样的减毒活疫苗通过降低所使用病毒的毒力但仍使其保持存活(或"活的"）进行 制备。
[0004] 然而，活疫苗的安全不断被讨论，因为它们还与遗传不稳定性和残留毒力相关 (Ehrenf eld等人，Expert · Rev .Vaccines 8:899-905，2009)。如对于 Sabin 脊髓灰质炎疫苗 所见的减毒突变的可能逆转（Salk，D.和Salk，J. ,Vaccine 2: 59-74,1984;Kew等人， Annu. Rev.Microbiol. 59:587-635，2005)，或者寻找减毒的正确平衡(其例如使减毒呼吸道 合胞病毒(RSV)活疫苗的开发复杂化(Luongo等人，Vaccines 27:5667-5676，2009))，例证 了活疫苗的缺陷。
[0005] 考虑到使用活疫苗存在的局限性，病毒载体已作为有力和确定的方法出现，具有 与减毒活疫苗相似的免疫原性特征（Abdulhaqq等人，ImmunoL· Res · 42 : 219-232，2008 ; Liniger等人，Vaccine 27 : 3299-3305，2009; Zhan等人，Vaccine 26: 3480-3488，2008 ; Slobod等人，Vaccine 22:3182-3186，2004)。然而，减毒活病毒载体通常面临与长期使用的 减毒活疫苗相似的安全性担忧。
[0006] 在过去受到疫苗开发者显著关注的病毒组是非节段负链RNA病毒(NNSV)组。这些 病毒具有非常期望的安全特征谱，因为它们含有RNA基因组且仅在宿主细胞的细胞质中复 制，从而排除整合到宿主基因组内以引起插入诱变的任何可能性。此外，尚未观察到重组事 件(Bukreyev等人，J. Virol. 80:10293-10306,2006) C3NNSV包含四个科，其中弹状病毒科 (Rhabdoviridae)(例如水疱性口炎病毒（VSV)和狂犬病病毒（RV))和副粘病毒科 (Paramyxoviridae)(例如仙台病毒(SeV)和人副流感病毒(hPIV))的成员已优先用于开发 候选病毒载体疫苗（Schmidt 等人，J.Virol.75:4594_4603,2001;Bukreyev 等人， J.Virol.80:10293-10306,2006)〇
[0007] 使用NNSV作为疫苗主链，已开发了各种病毒疫苗载体候选物。例如，通过将人副流 感病毒2型(hPIV2)的HN和F蛋白（其胞质结构域替换为人副流感病毒3型(hPIV3)的相应胞 质结构域）掺入基于hPIV3的病毒载体内，来产生hPIV2/hPIV3病毒疫苗载体（Tao等人， J · Virol · 74:6448-6458，2000)。此外，描述了牛/人减毒PIV3疫苗载体，其在牛PIV3(bPIV3) 主链中表达hPIV3的F蛋白（Haller等人，J. Virol. 74:11626-35,2000)。还已知的是表达人 PIV3的F和NH蛋白以及人RSV的全长天然F蛋白的基于牛PIV3的疫苗候选物，其被发现在非 洲绿猴中保护不受RSV感染(Tang等人，J. Virol .79:11198-11207,2004)。
[0008] 本领域已知的另一种候选病毒载体疫苗基于基因复制缺陷型仙台病毒（SeV) (Wiegand等人，J · Virol · 81:13835-13844，2007; WO 2006/084746 Al)。如最近所显示的，这 种载体还能够在体外表达基因（Bossow等人，Open Virol .J.6:73-81，2012)。然而，关于其 复制缺陷性质和遗传稳定性，基于复制缺陷型SeV的病毒疫苗载体的体内安全仍有待证明。 此外，由于其复制缺陷，体外基因表达相较于有复制能力的仙台载体的表达是降低的 (Bossow等人，Open Virol.J.6:73-81，2012)。因此，重组改造以在体内导致期望的有效体 液和/或细胞免疫应答的方式有效表达和展示所选免疫原性肽或蛋白质至免疫系统的复制 缺陷型仙台载体是有挑战性的任务。
[0009] -种公知的但难以治疗的致病性病毒是呼吸道合胞病毒(RSV) ^SV是全世界幼儿 和老年人中严重呼吸性疾病的主因 （Collins P.L.和Crowe J.E.Jr，Respiratory syncytial virus and metapneumovirus，in:Fields Virology,Eds .Knipe D.M.and Howley P.,Philadelphia:Lippincott-Williams and Wilkins,Wolters Kluwer Business ,2007 :1601-1646) ASV还是慢性阻塞性肺疾病（COPD)患者中的主要病原体 (Hacking，D.和HullJ.，夂11^(^.45:18-24,2002)。然而，尽管近期进行了显著的1?￥疫苗 开发努力，但现今仍无法获得针对该病原体的疫苗。
[0010] 因此，仍存在对于可有效用于治疗患有RSV感染和RSV感染相关疾病的患者特别是 儿童和老年人的安全RSV疫苗的迫切需要。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明通过提供表达嵌合RSV/SeV F(融合）蛋白的基因组复制缺陷型仙台病毒 (SeV)载体(在下文中被称为"本发明的基因组复制缺陷型SeV载体"或"本发明的rdSeV载 体"）而实现了上文提出的需要。本发明的rdSeV载体可以有效地大量产生，并且引发针对 RSV的强体液和细胞免疫应答，同时是安全的。它因此非常适合用作"半活"RSV疫苗，即，格 外有效(类似"活疫苗"）且还是特别安全(类似"死疫苗"）的疫苗。
[0013] 在第一个方面，本发明提供了包含核酸的基因组复制缺陷型仙台病毒(SeV)载体， 所述核酸在磷蛋白（P)基因中被修饰以编码缺乏氨基酸2-77的突变P蛋白，其中该核酸还编 码嵌合F蛋白，其包含呼吸道合胞病毒(RSV)F胞外域或其免疫原性片段或突变体、SeV F跨 膜结构域或其功能性片段或突变体、以及任选地SeV F胞质结构域或其任何片段或突变体。
[0014] 在另一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的基因组复制缺陷型仙台 病毒(SeV)载体、本发明的基因组复制缺陷型SeV载体的核酸或其互补体、和/或编码本发明 的基因组复制缺陷型SeV载体的核酸或编码该核酸的互补体的DNA分子。
[0015] 在本发明的其它方面，提供了用于产生本发明的基因组复制缺陷型仙台病毒 (SeV)载体的方法，其包括(i)培养本发明的宿主细胞，和（i i)从细胞培养物中收集基因组 复制缺陷型SeV载体。
[0016] 根据另一个方面，本发明提供了包含本发明的基因组复制缺陷型仙台病毒（SeV) 载体和一种或多种药学可接受的载体的疫苗。
[0017] 在另外一个方面，本发明涉及本发明的基因组复制缺陷型仙台病毒(SeV)载体在 治疗哺乳动物中的RSV感染或RSV感染相关疾病中的用途，所述哺乳动物特别是人受试者， 更特别是人类婴儿或儿童、老年人、人免疫妥协的个体、移植接受者或患有慢性疾病的个 体。
[0018] 本发明的优选实施方案示于所附从属权利要求中。
[0019] 附图简述
[0020] 当与附图结合阅读时，前述概述以及下述详述和实施例将得到更好理解。
[0021 ]图1是显示本发明的表达嵌合RSV/SeV F蛋白的基因组复制缺陷型SeV载体(指定 为"rdSeV-FRSV/SeV"载体)的基因组结构的图示。SeV F的胞外域替换为其RSV衍生的对应物， 从而导致下述嵌合F("Fchimi"）蛋白：RSV胞外域（"ecto" ；RSV F的氨基酸l-524)、SeV跨膜结 构域（"tm" ； SeV F的氨基酸500-523)和胞质结构域（"cyto" ； SeV F的氨基酸524-565)。在 "Pmut"ORF中，前76个氨基酸被删除(P Δ 2-77)以获得复制缺陷型疫苗载体。
[0022]图2是显示本发明的基因组复制缺陷型SeV载体的变体(指定为"rdSeV-FRSV/ SeV-A CT"）的基因组结构的图示。该变体等同于图1中所示的rdSeV-FRSV/SeV，但缺乏整个胞质结构 域，除了N末端前两个氨基酸(SeV F的氨基酸524-525)以外。在"Pmut"ORF中，前76个氨基酸 被删除(P A 2-77)以获得复制缺陷型疫苗载体。
[0023]图3是显示比较基因组复制缺陷型SeV载体（指定为"rdSeV-sFRsv"）的基因组结构 的图示，所述载体表达RSV的可溶性F(sF)蛋白。RSV F胞外域的0RF(RSV F的氨基酸1-524) 作为另外的转录单位（"sFrsv"）插入P基因的下游。在"Pmut"0RF中，前76个氨基酸被删除(P Δ 2-77)以获得复制缺陷型疫苗载体。
[0024]图4是显示本发明的基因组复制缺陷型SeV载体(rdSeV-FRSV/SeV)的生产效率的条 形图。rdSeV-FRSV/SeV载体在由表达质粒稳定转染的VPN细胞中产生，所述表达质粒含有编码 SeV P和N蛋白的基因。两种载体在不同传代水平（"P"）上的不同生产运行以比较(？1-111- 2、卩2-1、？2-2、？3-1)进行，并且在生产期间的不同时间点，例如在第8-11天（"(18-11"）、第 11-12天（"dll-12"）等等，获得来自细胞培养上清液的样品。随后测定所获得的样品的载体 滴度(pfu/ml)。
[0025]图5是显示rdSeV-FRSV/SeV(黑色条)及其变体（白色条）的生产效率的条形图，所述 变体缺乏整个胞质结构域，除了N末端前两个氨基酸之外（指定为"rdSeV-FRSV/SeV- Δ CT"）。 在第3天（"d2-3"）、第4天（"d3-4"）和第5天（"d4-5"）时，测定以pfu/ml表示的细胞培养上清 液的载体滴度。
[0026]图6是显示对于rdSeV-sFRSV、rdSeV-FRSV/SeV、活RSV和PBS，在鼻内（i.n.)施用（黑色 条)和肌内（i.m.)施用（白色条)后，RSV特异性血清IgG水平的条形图。血清样品在末次免疫 接种后14天抽取，并且通过ELISA测定RSV特异性IgG抗体的存在。
[0027] 图7是显示在用rdSeV-sFRSV、rdSeV-FRSV/SeV、活RSV和I3BS接种的小鼠的鼻洗涤物 (NW)中，RSV特异性IgA(粘膜抗体)应答(ng/ml)的条形图。NW样品在末次免疫接种后14天收 集，并且通过ELISA测定RSV特异性IgA抗体的存在。
[0028] 图8是显示在用rdSeV-sFRSV、rdSeV-FRSV/SeV、活RSV和PBS接种的小鼠的支气管肺泡 灌洗液(BAL)中，RSV特异性I gA (粘膜抗体)应答(ng/ml)的条形图。BAL样品在末次免疫接种 后14天收集，并且通过ELISA测定RSV特异性IgA抗体的存在。
[0029]图 9 是显示在用 rdSeV-sFRSV、rdSeV-FRSV/SeV、活 RSV 和 PBS 鼻内（i.n.)(黑色条)和肌 内（i.m.)(白色条)感染小鼠后，在血清中的中和抗体滴度的条形图。血清样品在末次免疫 接种后14天抽取，并且通过ELISA测定RSV特异性IgG抗体的存在。
[0030]图 10 是显示在用 rdSeV-sFRSV、rdSeV-FRSV/SeV、活 RSV 和 PBS 鼻内（i.n.)和肌内 (i 1)接种后，再刺激的脾细胞的IFN-γ表达(ng/ml)的条形图。脾细胞用灭活的RSV(白色 条)或作为阳性对照的伴刀豆球蛋白A(灰色条)进行再刺激。作为阴性对照，使用未受刺激 的脾细胞(黑色条）。
[0031] 图 11 是显示通过rdSeV-sFRSV(.)、rdSeV-FRSV/SeV(·)、活RSV(x)和PBS( ·)的鼻内 应用刺激的小鼠 RSV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的裂解活性(CTL应答)的图。细胞毒性 活性(特异性释放％)使用RSV感染的P815细胞(Μ0Ι 0.1)进行测量。将