toplasma)的 ALyS505N培养基（株式会社细胞科学研究所（CELLSCIENCE&TECHN0L0GY INST. ,INC. (CSTI)))添加至 50ml。
[0125] 4)向IL的培养用袋(culture bag)注入50ml的细胞悬浮液之后，在C〇2培养箱中培 养。
[0126] 5)培养第4天，向IL的培养用袋追加注入了50ml的包含lOOOU/ml的白细胞介素-2 及3 %的自体血浆的ALyS505N培养基。
[0127] 6)培养第7天，向IL的培养用袋追加注入了IOOrnl的包含1000U/ml的白细胞介素-2 及3 %的自体血浆的ALyS505N培养基。
[0128] 7)培养第9天，向IL的培养用袋追加注入了300ml的包含1000U/ml的白细胞介素-2 及3 %的自体血浆的ALyS505N培养基。
[0129] 8)培养第11天，向IL的培养用袋追加注入了500ml的包含lOOOU/ml的白细胞介素- 2及3 %的自体血浆的ALyS505N培养基。
[0130] 9)培养第14天，收集IL的培养用袋的所有细胞，来用注射用生理食盐水清洗三次， 并且在包含5%的白蛋白的注射用生理食盐水中悬浮细胞来充电完成品T细胞治疗剂。
[0131] 如上所述，通过本发明的表位筛选从临床癌症患者筛选可诱导T细胞反应的3-4种 的3分以上的肽之后，利用50cc的血液来执行人端粒酶逆转录酶、WT、NY-ESO1、黑素瘤抗原-A3T细胞治疗剂的试生产，其结果在表6至表9中进行整理。
[0132] 图14为用于说明人端粒酶逆转录酶T细胞治疗剂的试生产过程的图。
[0133] 图14为从50cc的具有人类白细胞抗原_A*24等位基因（allele)的胃癌患者的血液 中分离外周血单个核细胞，来分别以lμg/ml的浓度添加三种人端粒酶逆转录酶肽 (peptide)[CLKELVARV(序列1)、PLFLELL(序列2)及AAVTPAA(序列3)]之后，根据在上述实施 例3的"(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖"中记述的过程进行了培养。培养第14天，收 集全部细胞来根据"(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选"过程，与人端粒酶逆转录酶肽 发生反应，从而分离/增殖了已增殖的T细胞。通过"(3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量 培养"过程，分离的T细胞以可给药到癌症患者的水平进行大量培养，并且根据流式细胞分 析，最终培养的细胞为具有低的老化度和作用功能的特定TCRVb型的T细胞。
[0134] 图15为用于说明WTlT细胞治疗剂的试生产过程的图。
[0135] 图15为从50cc的具有人类白细胞抗原_A*24等位基因的恶性神经胶质瘤患者的血 液中分离外周血单个核细胞，来分别以lμg/ml的浓度添加四种WTl肽（WT1 peptide) [SLGEQQVSV(序列4)、RMFPNAPVL(序列5)、CMTWNQMNL(序列6)、VLDFAPPGA(序列7)]之后，根 据在上述实施例3的"(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖"中记述的过程进行培养。培 养第14天，收集全部细胞，来根据"(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选"过程，与WTl肽 发生反应，从而分离/增殖了已增殖的T细胞。通过"(3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量 培养"过程，分离的T细胞以可给药到癌症患者的水平进行大量培养，并且根据流式细胞分 析，最终培养的细胞为具有低的老化度和作用功能的特定TCRVb型的T细胞。
[0136] 图16为用于说明NY-ESOl T细胞治疗剂的试生产过程的图。
[0137] 图16为从50cc的具有人类白细胞抗原_A*24等位基因的卵巢癌患者的血液中分离 外周血单个核细胞，来分别以lμg/ml的浓度添加四种NY-ESOl肽（NY-ES01 peptide) [SISSCLQQL (序列8)、RLLEFYLAM (序列9)、GVLLKEFTV (序列 10)、ILTIRLTAA (序列 11)]之后， 根据在上述实施例3的"(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖"中记述的过程进行培养。 培养第14天，收集全部细胞，来根据"(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选"过程，与NY-ESOl肽发生反应，从而分离/增殖了已增殖的T细胞。通过"(3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞 的大量培养"过程，分离的T细胞以可给药到癌症患者的水平进行大量培养，并且根据流式 细胞分析，最终培养的细胞为具有低的老化度和作用功能的特定TCRVb型的T细胞。
[0138] 图17为用于说明黑素瘤抗原-A3T细胞治疗剂的试生产过程的图。
[0139] 图17为从50cc的具有人类白细胞抗原_A*24等位基因的肉瘤患者的血液中分离外 周血单个核细胞，来分别以lμg/ml的浓度添加四种黑素瘤抗原-A3肽(MAGE-A3 peptide) [LLIIVLAII (序列 12)、KIWEELSVL(序列 13)、LVFGIELMEV(序列 14)、SLPTTMNYPL(序列 15)]之 后，根据在上述实施例3的"(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖"中记述的过程进行培 养。培养第14天，收集全部细胞，来根据"(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选"过程，与 黑素瘤抗原-A3肽发生反应，从而分离/增殖了已增殖的T细胞。通过"(3)自身癌抗原特异性 CD8+T细胞的大量培养"过程，分离的T细胞以可给药到癌症患者的水平进行大量培养，并且 根据流式细胞分析，最终培养的细胞为具有低的老化度和作用功能的特定TCRVb型的T细 胞。
[0140]以上，以优选的多个实施例为中心对本发明进行了观察。本发明所属技术领域的 普通技术人员可以理解在不脱离本发明的本质特性的范围内能够以变形的形态来实现本 发明。因而所公开的实施例不应从限定的观点考虑，而应从说明的观点考虑。本发明的范围 未示于上述说明中，而示于发明要求保护范围中，在与其等同的范围内的所有差异应解释 为包含于本发明中。
【主权项】
1. 一种自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法，其特征在于，包括： 步骤a)，筛选存在于癌症患者血液内的自身癌抗原CD8+T细胞表位； 步骤b)，与上述表位的肽及白细胞介素-2 -同在培养基中培养从癌症患者的血液中分 离的外周血单个核细胞； 步骤c)，在培养的上述外周血单个核细胞中添加与步骤b)相同的肽来诱导4-1BB表达； 以及 步骤d)，在涂敷有抗-4-1BB抗体的培养板中培养诱导了4-1BB表达的细胞之后，去除未 附着的细胞。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤a)的自身癌抗原选自由人端粒酶 逆转录酶（基因库：BAC11010.1)、WT1(基因库:AA061088.1)、NY-ES01(基因库：CAA05908.1) 及黑素瘤抗原_A3(NCBI参考序列:NP_005353.1)组成的组中。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在上述步骤b)中，表位为包含选自由序列1 至序列15组成的组中的氨基酸序列的肽。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤b)中，培养基为包含自体血浆的 培养基。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤b)中，培养12至16天。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤c)中，表达诱导培养12至36小时。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤d)中，培养1至20分钟。8. -种自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法，其特征在于，包括如下步骤:利用 包含白细胞介素-2、抗-CD3抗体及自体血浆的培养基，来使通过权利要求1所述的方法分离 的自身癌抗原特异性CD8+T细胞和放射线照射的同种异体外周血单个核细胞悬浮之后，注 入于培养用袋，追加注入上述培养基来进行培养。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，上述外周血单个核细胞从正常供体分离。10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，上述培养执行4至15天。11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在执行上述培养期间，在培养第4天、第7 天、第9天、第11天及第14天追加注入培养基。
【专利摘要】本发明涉及自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法，详细地涉及如下方法及利用其的CD8+T细胞的大量增殖方法，在上述方法中，从存在于癌症患者每个人的血液内的自身癌抗原筛选由CD8+T细胞识别的表位，并利用已筛选的表位的肽来分离对自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。根据本发明，利用作为非外来抗原的存在于癌症患者的每个人的血液的自身癌抗原CD8+T细胞表位的肽来可分离对自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。因此，若利用识别自身癌抗原的T细胞，则可有效地选择来源于癌症患者本人的细胞的癌细胞来去除，因而可无副作用地应用于癌症的治疗及改善。
【IPC分类】C12Q1/24, C12N5/0783
【公开号】CN105473731
【申请号】CN201580001522
【发明人】权炳世, 姜铉贵, 金光挥, 金荣雨, 金永昊, 朴丙圭, 朴相润, 朴商在, 严炫皙, 吴好植, 刘宪, 李敦吉, 李承勋, 李映宙, 李振洙, 崔范奎
【申请人】国立癌Center
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年3月11日
【公告号】US20150259646, WO2015137724A1