一种用于制备渔用免疫佐剂的多肽及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学领域，具体涉及一种用于制备渔用免疫佐剂的多肽及其用途。
【背景技术】
[0002] 随着现代水产养殖集约化程度的日益提高，养殖鱼类暴发的疾病所造成的损失越 来越严重，鱼类病害已经成为阻碍水产养殖业健康发展的重要因素。海豚链球菌 (Streptococcus iniae，S. iniae)病是一种感染性极强的细菌性疾病，可在包括淡水鱼和 海水鱼在内的多种野生或人工养殖鱼类中引起爆发性鱼病，导致鱼群大量死亡。而且，海豚 链球菌还可以通过伤口感染人，引发人类蜂窝织炎、心内膜炎、关节炎、脑膜炎、脊髓炎等。
[0003] 海豚链球菌病目前主要依靠化学药物进行防治，但化学疗法有很多弊端，会带来 抗药性和药物残留问题。相比而言疫苗接种既可有效地预防水产动物疾病，又能避免抗生 素等药物对水环境和水产品本身造成的污染，已成为国际上水产疫病防控的主流方向。
[0004] 随着海豚链球菌基因工程疫苗的发展，对免疫佐剂的需求也大为增加。免疫佐剂 也称佐剂或抗原佐剂，不仅可以增强抗原的免疫原性而且还可以提高免疫效果。传统免疫 佐剂是简单化合物形式，如油佐剂或简单铝盐等。但是，由于许多佐剂可以引起剧烈的局部 反应或全身毒性反应而应用受限。细胞因子是机体的自身成分，不会对机体产生毒副作用， 相比传统佐剂具有独特的优势。
[0005] 目前还没有将细胞因子用于制备海豚链球菌疫苗免疫佐剂的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于制备免疫佐剂的多肽及其用途。
[0007] 本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多肽。
[0008] 本发明还提供了编码上述多肽的基因。
[0009] 进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[00?0]本发明还提供了氣基酸序列如SEQ ID NO: 1所不的蛋白，或者上述基因在制备免 疫佐剂中的用途。
[0011] 其中，所述免疫佐剂是渔用疫苗的免疫佐剂。
[0012] 其中，所述免疫佐剂是海豚链球菌亚单位疫苗的免疫佐剂。
[0013] 进一步地，所述海豚链球菌亚单位疫苗的抗原是氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示 的多肽。
[0014] 本发明还提供了一种免疫佐剂，它是以氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多肽，加 入药学上可接受的辅助性成分制备而成的制剂。
[0015] 本发明还提供了一种疫苗，它包括抗原以及上述免疫佐剂。
[0016] 进一步地，所述抗原是氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的多肽。
[0017] SEQ ID NO: 1所示多肽的氨基酸序列：
[0018] GEGKAERCFCQKKALEKVRPALVKKFEVFPPSASCSNTGIILSLKQGMKVCLDPEGNQGQKVLTGQKLKIKSKGRRG KKQKKIKQQN
[0019] SEQ ID N0:2所示基因的核苷酸序列：
[0020] ggagaaggaaaagcagagcgttgtttctgccaaaagaaagcactggaaaaggtaagacctgcacttgtgaagaagtt tgaggtattccctccaagtgcctcctgttcaaatactgggatcatattatctctgaagcaaggaatgaaggtctgcc tggacccagaaggaaaccaaggacagaaagtcttaactggacagaaactaaagataaagtccaagggaagaagggga aagaagcagaagaagatcaaacagcaaaactga
[0021] SEQ ID NO :3所示多肽的氨基酸序列：
[0022] MSIITDVYAREVLDSRGNPTLEVEVYTESGAFGRGMVPSGASTGEHEAVELRD⑶KSRYLGLGTEKAVDNVNNIIAE AIIGFDVRDQQAIDRAMIALDGTPDKGKLGANAILGVSIAVVRAAADYLEVPLYNYLGGFNAKVLPTPMMNIINGGS HSDAPIAFQEFMIMPVGAPTFKEALRWGAEVFHALKKILKERGLVTAVGDEGGFAPKFEGTEDGVETILKAIEAAGY EAGENGIMIGFDCASSEFYDKERGVYDYTKFEGEGAAVRTSAEQIDYLEELVNKYPIITIEDGMDENDWDGWKVLTE RLGGRVQLVGDDFFVTNTDYLARGIKEEAANSILIKVNQIGTLTETFEAIEMAKEAGYTAVVSHRSGETEDSTIADI AVATNAGQIKTGSLSRTDRIAKYNQLLRIEDQLGEVAQYKGIKSFYNLKK
[0023] 本发明的斑点叉尾鮰IL-8多肽，能显著增强疫苗尤其是海豚链球菌亚单位疫苗的 免疫保护效力，可以作为疫苗的佐剂使用;本发明的免疫疫苗制备简单、安全有效;而且本 发明多肽和疫苗使用方便，为海豚链球菌病的防治提供了新的有效选择。
[0024] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0025] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0026]图1是斑点叉尾鮰IL-8成熟肽基因的PCR扩增(A)和重组克隆质粒PMD19-T-mCcIL-8的PCR鉴定以及单、双酶切鉴定(B)图；
[0027] A.M:DNA分子质量标准(DL2000); 1 :PCR产物；
[0028] B.M1:DNA分子质量标准（DL2000) ;l:pMD19-T-mCcIL-8的PCR鉴定；2:pMD19-T-mCcIL-8的双酶切鉴定(EcoR I和Xho I);3:pMD19-T-mCcIL-8的单酶切鉴定(EcoR I);M2: DNA分子质量标准(DL10000)。
[0029] 图2是重组表达质粒pET32a( + )-mCcIL-8的PCR鉴定以及单、双酶切鉴定图；
[0030] M1:DNA分子质量标准（DL2000) ;l:pET32a( + )-mCcIL-8的PCR鉴定；2:pET32a( + )-mCcIL-8的双酶切鉴定(EcoR I和Xho I);3:pET32a( + )-mCcIL-8的单酶切鉴定(EcoR I); M2:DNA分子质量标准(DL10000)。
[0031] 图3是重组表达质粒pET32a( + )-mCcIL-8表达产物的SDS-PAGE分析图；
[0032] M:蛋白质分子质量标准；1:未诱导表达pET-32a( + )/BL21 (DE3)产物；2:诱导表达 pET-32a( + )/BL21(DE3)产物;3:未诱导表达 pET-32a( + )-mCcIL-8/BL21(DE3)产物;4:诱导 表达pET-32a (+) -mCc IL-8/BL21 (DE3)。
[0033]图4是重组表达质粒pET32a( + )-mCcIL-8表达产物的可溶性分析及纯化(A)和重组 mCcIL-8蛋白的 Western-blot检测（B)图；
[0034] A.M:蛋白质分子质量标准；1:未诱导表达pET-32a( + )/BL21 (DE3)产物；2:诱导表 达 pET-32a( + )/BL21(DE3)产物;3:未诱导表达 pET-32a( + )-mCcIL-8/BL21(DE3)产物;4:诱 导表达 pET-32a( + )-mCcIL-8/BL21(DE3);5:诱导表达 pET-32a( + )-mCcIL-8/BL21(DE3)超声 波裂解上清;6、诱导表达PET-32a( + )-mCcIL-8/BL21(DE3)超声波裂解沉淀;7、纯化后的重 组mCcIL-8蛋白；
[0035] B.M:预染蛋白分子质量标准；1:重组mCcIL-8蛋白。
[0036]图5是各组试验鱼血清溶菌酶活力图。
[0037] 图6是各组试验鱼血清ACH5Q活性图。
[0038]图7是各组试验鱼抗体水平检测图。
[0039]图8是qRT-PCR检测各组试验鱼免疫相关基因的表达图。
[0040] 说明：图5-8中，大写字母A、B、C和D表示各组分别与PBS组、rmCcIL-8组、S.iniae-rENO组和S.iniae-rEN0+rmCcIL-8组相比差异极显著(P〈0.01)，小写字母a、b、c和d表示各 组分别与 PBS 组、rmCcIL-8 组、S.iniae-rENO 组和 S.iniae-rEN0+rmCcIL-8 组相比差异显著 (Ρ〈0·05)。
[0041 ]图9是不同试验组攻毒后各组的累计死亡率统计图。
【具体实施方式】
[0042] 下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
[0043] 本发明所用的实验