miRNA145-5p修饰脐带间充质干细胞分泌的外泌体及其制备与应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用microRNA145-5p、修饰脐带间充质干细胞 (human umbilical cordmesenchymal stem cell，hucMSC)中的外泌体（exosome)提取制备 的方法以及其在促进创面愈合并抑制瘢痕增生，尤其是关节部位拮抗瘢痕治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 肌成纤维细胞(myofibroblast)是一种表达平滑肌肌动蛋白（α-SMA)的由成纤维 细胞高度分化而来的细胞，它参与了纤维化级联反应中纤维形成和细胞外基质重塑两个阶 段（Van De Water L,Varney S,Tomasek JJ,Mechanoregulation of the Myofibroblast in Wound Contraction,Scarring,and Fibrosis:Opportunities for NewTherapeu tic Intervention. 2013May; 2(4): 122-141)。它的主要功能是产生力量和改变组织张力，是创 面肉芽收缩和纤维收缩性疾病主要的细胞。这些细胞大量分泌胶原、纤维连接蛋白、生长因 子和各种酶类。当组织由于氧化应激、低氧状态、炎症、凋亡等刺激而受到损伤时，虽然通过 用细胞外基质将损伤组织置换而试图进行修复，但损伤很严重时或者该刺激变为慢性化时 等，肌成纤维细胞分化则不受调控进而引起不适当或过度的纤维结缔组织生成，而在皮肤 损伤引起的过度瘢痕增生，在关节部位引起的瘢痕粘连挛缩都可以一并认为肌成纤维细胞 的过度增生。更有文献表明它的存在与促进肿瘤生长也有直接关系(Junker JP^Kratz C， TollbackA,Kratz G,echanical tension stimulates the transdifferentiation of fibroblasts into myofibroblasts in huma n burn scars.Burns.2008Nov；34(7):942-6)〇
[0003] 近年来，干细胞相关机制及应用在创面修复领域有了新的突破。研究表明间充质 干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能够促进皮肤创面的愈合并且诘抗瘢痕过度形 成。但其本身在移植入新环境后存活数量随时间急剧下降。其发挥主要作用的是通过旁分 泌产生的一些活性因子影响了创面的微环境，进而促进创面愈合、抑制组织过度纤维化并 且维持较良好的形态（Nie C，Yang D，Xu L et al .Locally administered adipose- derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and Vasculogenesis[J].Cell Transplant，2011，20(2):205-216)〇
[0004] 外泌体(exosome)作为来自干细胞细胞旁分泌的一种脂质双分子膜包裹的小囊泡 越来越受到关注。它由细胞的多囊体与质膜融合后，以胞吐的方式释放到胞外环境中。表面 含有大量与其来源和功能密切相关的蛋白质、脂质成分以及核酸，其中以microRNA为主 (Simpson RJ,Lira Jff,Moritz RL,et.Exosomes：proteomic insights and diagnostic potential[J] .Expert Rev Proteomics,2009,6(3) ：267一283)。外泌体较易与邻近细胞的 细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传 递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。（Record M，Subra C，et al.Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectom[J].Biochem ?1^现36〇1，2011，81(10):1171-1182)。后续的研究又证实外泌体中的11^(^〇1?祖在不同酸 碱环境、缺氧、高温、反复冻融等恶劣条件下仍能保持较高稳定性，还能对抗RNase的作用， 主要是因为外泌体可将microRNA包裹并保持其完整性(Umezu T，Ohyashiki K，Kuroda M， et al.Leukemia cell to endothelial cell communication via exosomal miRNAs[J] .Oncogene，2013，32(22): 2747-55.)。因此，间充质干细胞可能是通过此机制将有利于创 面愈合及诘抗瘢痕的miRNA传递至伤口周围并发挥功能。
[0005] hsa_miR-145(miR-145，Accession number:MIMAT0000437)作为一个研究相对透 彻的microRNA，之前已有其在调控肿瘤增殖方面的报道，如中国专利CN201110311076.2，申 请公布号为CN102676516A，发明名称为"microRNA-145的新用途"，提供了 miR-145过表达后 可显著增强高转移性大肠癌细胞的侵袭和迀移能力。miR-145其前体序列在正常生理情况 下能够生成两种不同的成熟体即hsa-miR-145_5p (miR_145_5p，Access ion number : MIMAT0000437)与 hsa-miR-145_3p (miR-145_3p，Access ion number :MIMAT0004601)。该两 种成熟体在创伤领域研究甚少，而其成熟体之一的miR-145-5p被报道能够参与调控TGF-i3/ SMADS信号传导通路，而该通路在创面修复方面广泛存在并起到重要作用(参考文献Heldin CH，LandstrSm M，Moustakas A.Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest， apoptosis,and epithetlial-mesenchymal transition[J].Curr Opin Cell Biol,2009, 21:166-176)。干扰TGFiVSMAD可调控成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化继而减轻过度纤维 化，因此对该通路具有调控作用的miR-145-5p可能对成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化具 有重要作用。
[0006] 目前尚无有关miR-145-5p修饰外泌体的文献报道;更无 miR-145-5p修饰脐带间充 质干细胞分泌的外泌体用于创面治疗领域的相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供以hsa-miR-145-5p(miR-145-5p)修饰的脐带间充质干细胞 分泌的外泌体及其制备方法;本发明的另一目的在于提供miR-145-5p修饰的脐带间充质干 细胞分泌的外泌体在加速皮肤创面愈合并同时抑制瘢痕过度增生药物中的应用。
[0008] 本专利将间充质干细胞来源的外泌体进行改良修饰，过表达抑制肌成纤维细胞形 成的miR-145-5p，开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和 肿瘤形成缺陷的新型治疗手段，不仅促进创面的愈合，同时也预防了瘢痕的过度增生，为 mi croRNA的靶向治疗提供新的思路。
[0009] 本发明的第一方面，提供了 一种以microRNA145-5p修饰的脐带间充质干细胞分泌 的外泌体，所述的外泌体是由过表达Mi croRNAl 45-5p的脐带间充质干细胞分泌的。
[0010] 所述的过表达MicroRNA145_5p的脐带间充质干细胞中miR-145_5p，Accession number:MIMAT0000437,具体序列如下：guccaguuuucccaggaaucccu(SEQ ID NO: 1) 〇
[0011]其中脐带间充质干细胞，可选自新鲜脐带培养人脐带间质干细胞，详细步骤参照 实施例一。也可以通过美国ScienCell公司购得。
[0012]本发明的第二方面，提供了上述以microRNA145-5p修饰的脐带间充质干细胞分泌 的外泌体的制备方法。步骤如下：
[0013] A.脐带间质干细胞的传代培养；
[0014] B.制备过表达microRNA145-5p的脐带间充质干细胞；
[0015] C.条件培养基的储备，所述的条件培养基为干细胞培养基中加入步骤B获得的过 表达micr 〇RNA145-5p的脐带间充质干细胞，48h-72h后的上清液；
[0016] D.外泌体的抽提与纯化。
[0017]其中，步骤A较优的是:取新生儿的新鲜脐带，经磷酸盐缓冲液反复冲洗后，浸泡于 含有1 %青链霉素的L-DMEM约5分钟，剪成直径约1.5mm大小的组织块;含10 %胎牛血清L-DMEM营养液，5 %C02、37°C饱和湿度培养;待7-10日后可见间充质干细胞爬出组织，去除组 织块后以0.25 %胰蛋白酶消化进行传代培养。
[0018] 步骤B较优的是:制备高表达miRNA145-5p间充质干细胞，体外培养。选自步骤I)或 者步骤Π ):
[0019] I)人工合成Micr〇RNA145-5p的成熟体，经脂质体转染第3-6代间充质干细胞，获 得MicroRNA 145-5p高表达的间充质干细胞;其中micr〇RNA145-5p成熟体的构建方法为常 规方法，可参见工具书(著[美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版 社），由上海吉玛公司合成.
[0020] Π )构建含有MicroRNA145-5p的编码基因的重组载体、构建含有MicroRNA145-5p 的编码基因的重组病