一种用于单细胞全基因组扩增的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于单细胞全基因组扩增的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着流式细胞仪和激光显微切割技术的应用发展，分离单个目标细胞成为一件相 对容易的事情。单细胞具有该物种的全部基因组信息，与获自多细胞的基因组样本相比， 获自单细胞的基因组样本没有细胞异质性等缺陷，因此单细胞具有重要的遗传分析应用价 值。随着第二代高通量测序技术的成熟与推广应用，基于基因测序的遗传学分析也随之发 展起来，然而大多数遗传分析最基本的要求是具有足够数量的高质量基因组DNA，为了使单 细胞能够满足遗传分析的需求，如何从单细胞样本中获得足够多的高质量基因组DNA就成 了一个关键技术。
[0003] 全基因组扩增技术（Whole Genome Amplification，WGA)是一种从有限DNA或者单 个细胞中产生足量DNA的体外扩增方法。当前，主要有两种不同的策略来实现WGA，分别是 基于PCR的扩增策略和基于Phi29DNA聚合酶的恒温扩增策略。其中最具代表性的方法包 括简并寡核苷酸引物 PCR(Degenerate Oligonucleotide-Primed PCR，D0P_PCR)和多重置 换扩增（Multiple Displacement Amplification, MDA)。越来越多的研究发现，以 D0P-PCR 为代表的基于PCR的WGA，会出现覆盖率低、杂合子丢失，不能在单个核苷酸的分辨率上评 价单个细胞的遗传学特征等缺陷，这些都极大限制了该技术的应用范围。相较于D0P-PCR， MDA是目前公认为最好的WGA。MDA利用随机引物与模板DNA在多个位点退火结合，随后 Phi29DNA聚合酶在多个退火结合位点处同时起始复制，Phi29DNA聚合酶沿着模板合成新 的DNA，同时取代模板的互补链，被置换的互补链又成为新的模板，被随机引物结合后进行 扩增。基于Phi29DNA聚合酶的MDA具有以下优点：（1)不需要经过高温变性，用相对较温 和的碱性裂解法使DNA释放，能减少模板的降解；（2) Phi29DNA聚合酶对模板有很强的结合 能力，同时具有3' 一 5'外切酶活性，可以保证DNA复制的高保真性；（3)Phi29DNA聚合酶 具有很强的连续合成能力，扩增产量高，可以满足所有下游的核酸分析要求。
[0004] 目前，市场上的MDA试剂盒以QIAGEN公司生产的REPLI-g系列产品为主，其高效 稳定的扩增效果拥有很高的评价。但是，伴随而来的高扩增成本，也成为制约其产业化道路 的重要因素。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于单细胞全基因组扩增的试剂盒及其应用。
[0006] 本发明首先保护一种用于单细胞基因组扩增的试剂盒，包括扩增体系乙；
[0007] 所述扩增体系乙由10父？1^29131^€6广水和扩增体系甲组成；
[0008] 单份扩增体系甲由（1. 8-2. 2) X 10 smol dNTP、引物总浓度为（1. 8-2. 2) X 10 nmol N8primers、（4. 5-5. 5)X10 3mg BSA、0. 0045-0. 0055 μ 1 Pluronic F68 和 9-11U Phi29DNA 聚合酶组成；所述NSprimers为随机引物，由8个脱氧核糖核苷酸组成，A、G、C和T随机排 列。
[0009] 所述单份扩增体系甲具体可由2X 10 8mol dNTP、2X 10 nmol所述N8primers、 5X103mg BSA、0.005yl Pluronic F68 和 10U Phi29DNA 聚合酶组成。
[0010] 本发明还保护另一种用于单细胞基因组扩增的试剂盒，包括扩增体系乙；
[0011] 单份扩增体系乙为 40. 3μ 1，由 30μ 1 Η20、5μ 1 10XPhi29buffer、2y 1 dNTP 溶 液、2 μ 1 N8primers 溶液、0· 25 μ 1 20mg/ml 的 BSA 水溶液、0· 05 μ 1 10% Pluronic F68 溶 液和1 μ 1 Phi29DNA聚合酶溶液组成；
[0012] 所述 dNTP 溶液中，dATP/dTTP/dCTP/dGTP 的浓度均为 10mM ;所述 N8primers 溶液 中，引物总浓度为1〇μΜ;所述10%Pluronic F68溶液中，10%代表体积比；所述Phi29DNA 聚合酶溶液中Phi29DNA聚合酶的浓度为lOU/μ 1 ;
[0013] 所述NSprimers为随机引物，由8个脱氧核糖核苷酸组成，A、G、C和T随机排列。
[0014] 以上任一所述试剂盒还可包括细胞变性裂解液和中和缓冲液；
[0015] 所述细胞变性裂解液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度如下： 0· 09-0. llmM Κ0Η、0· 9-1. ImM EDTA 和 0· 09-0. 11M DTT ;
[0016] 所述中和缓冲液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度如下：54-66mM ΚΗ 2Ρ04 和 4. 5-5. 5mM Κ2ΗΡ04〇
[0017] 所述细胞变性裂解液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度具体如下： 0·ImM Κ0Η、ImM EDTA 和 0· 1M DTT ;
[0018] 所述中和缓冲液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度具体如下：60mM ΚΗ2Ρ0 4 和 5mM Κ2ΗΡ04。
[0019] 本发明还保护一种单细胞基因组扩增的方法，包括如下步骤：
[0020] (1)取单个细胞，进行细胞裂解，得到模板溶液；
[0021] (2)将步骤⑴得到的全部模板溶液与扩增体系乙混合，得到初始反应体系，然后 进行反应，得到扩增产物；
[0022] 所述扩增体系乙由10父？1^29131^€6广水和扩增体系甲组成；
[0023] 所述扩增体系甲由 dNTP、N8primers、BSA、Pluronic F68 和 Phi29DNA 聚合酶组成； 所述NSprimers为随机引物，由8个脱氧核糖核苷酸组成，A、G、C和T随机排列；
[0024] 所述初始反应体系中，溶剂为lXPhi29buffer ;
[0025] 所述扩增体系甲中的各个组分在所述初始反应体系中的浓度如下：0. 36-0. 44mM dNTP、引物总浓度为 0· 36-0. 44μΜ 的 N8primers、0. 09-0. llmg/ml BSA、0. 009% -0· 011% 体积比的 Pluronic F68 和 0· 18-0. 22υ/μ 1 Phi29DNA 聚合酶。
[0026] 所述扩增体系甲中的各个组分在所述初始反应体系中的浓度具体如下：0.4mM dNTP、引物总浓度为 0· 4 μ Μ 的所述 N8primers、0. lmg/ml BSA、0. 01 % 体积比的 Pluronic F68 和 0· 2U/ μ 1 Phi29DNA 聚合酶。
[0027] 所述步骤（1)中，采用细胞变性裂解液进行所述细胞裂解，采用中和缓冲液终止 所述细胞裂解；
[0028] 所述细胞变性裂解液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度如下： 0· 09-0. 1ImM Κ0Η、0· 9-1. ImM EDTA 和 0· 09-0. 11M DTT ;
[0029] 所述中和缓冲液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度如下：54-66mM ΚΗ2Ρ04 和 4· 5-5. 5mM Κ2ΗΡ04〇
[0030] 所述细胞变性裂解液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度具体如下： 0·ImM KOH、ImM EDTA 和 0· 1M DTT ;
[0031] 所述中和缓冲液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度具体如下：60mM ΚΗ2Ρ0 4 和 5mM Κ2ΗΡ04。
[0032] 所述步骤（2)中，所述反应的条件为：30°C静置3h，随后65°C静置5分钟。
[0033] 本发明还保护另一种单细胞基因组扩增的方法，包括如下步骤：
[0034] (1)取单个细胞，加入3. 7 μ 1 PBS缓冲液和3 μ 1细胞变性裂解液，65°C静置10分 钟，然后加入3 μ 1中和缓冲液，得到9. 7 μ 1模板溶液；
[0035] (2)取步骤（1)得到的9. 7 μ 1模板溶液，加入单份扩增体系乙，30°C静置3h，随后 65 °C静置5分钟，得到扩增产物；
[0036] 单份扩增体系乙为 40. 3 μ 1，由 30 μ 1 Η20、5 μ 1 10XPhi29buffer、2 μ 1 dNTP 溶 液、2 μ 1 N8primers 溶液、0· 25 μ 1 20mg/ml 的 BSA 水溶液、0· 05 μ 1 10% Pluronic F68 溶 液和1 μ 1 Phi29DNA聚合酶溶液组成；
[0037] 所述 dNTP 溶液中，dATP/dTTP/dCTP/dGTP 的浓度均为 10mM ;所述 N8primers 溶液 中，引物总浓度为1〇μΜ;所述10%Pluronic F68溶液中，10%代表体积比；所述Phi29DNA 聚合酶溶液中Phi29DNA聚合酶的浓度为lOU/μ 1 ;
[0038] 所述NSprimers为随机引物，由8个脱氧核糖核苷酸组成，A、G、C和T随机排列。
[0039] 所述PBS缓冲液具体可为ρΗ7· 5、0· 1M的PBS缓冲液。
[0040] 所述细胞变性裂解液由溶质和