耐除草剂大豆dp-356043及其衍生品种的lamp检测引物组、lamp检测试剂盒及检测方法
【专利说明】耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、
LAMP检测试剂盒及检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，属于转基因农作物的检测方法，具体是耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]目前世界上大豆种植已遍及五十多个国家和地区，主产地主要是美国、巴西、阿根廷和中国，中国是栽培大豆的起源地。随着中国经济的发展，城市化进程加快，居民对大豆以及其副产品的消费日益增加，而且大豆广泛用于食品、医药和化学工业，但是国产大豆产量增长达不到市场需求，进口大豆的数量逐渐增加。
[0003]杜邦先锋国际良种公司研制转基因抗两种除草剂的大豆DP-356043，对草甘膦与磺酰脲类(SU)除草剂表现为双重抗性。转入GAT基因，编码对除草剂草甘膦的抗性，乙酰乳酸合成酶(ALS)基因GM-HRA，编码对磺酰脲类(SU)除草剂的抗性。DP-356043通过基因枪转化得到，插入序列为单拷贝。
[0004]我国已经批准抗除草剂大豆DP-356043作为可进口用作加工原料，为了对抗除草剂大豆DP-356043的流通进行规范管理，建立有效的抗除草剂大豆DP-356043的检测方法与体系，对转基因作物及其产品标识制度的实施和安全性评价具有十分重要的意义。
[0005]目前，转基因作物的检测方法主要有以下2类:
1)基于蛋白质的检测，现在应用最广的是酶联免疫吸附法(ELISA)以及Westernblot的检测方法，这类方法要求高质量、高特异性的抗体，否则会影响检测的准确性，检测的灵敏度较低；
2)基于DNA的检测，主要是针对转基因作物中的外源插入基因进行检测，主要有分子杂交技术、PCR检测技术和芯片检测技术，其中PCR检测方法是最主要、最准确的检测转基因作物的方法，但这类方法的反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；需要特定的PCR仪，扩增时间2?3小时，扩增结果需要进行终产物检测如电泳；电泳常用染料如EB等有较强毒性，且难以实行现场检测。定量PCR检测灵敏度高，所使用的荧光种类主要Taqman探针、SYBR Green I和分子信标，随着反应进行，体系中产生的焚光信号值随之增大。其他两种方法较SYBR GreenI染料法灵敏度相对较高，但是荧光定量PCR仪器成本较大。
[0006]综上所述，在生产实践中均需要一种快速、灵敏度高、操作简便、特异性强、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。
[0007]环介导等温基因扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplificat1n，以下简称LAMP法)是Notomi和0kayama2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将恒温扩增目视检测技术、恒温实时荧光技术应用于快速检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的试剂盒。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0009]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示:
外引物1:CATAACCTCATCTCGCCTT(SEQ ID No:l)；
外引物2:CAATGGAATCCGAGGAGG(SEQ ID No:2)；
内引物1:AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAA C(SEQ ID No:3)；
内引物2:TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGT ATCCSEQ ID No:4)。
[0010]耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分:
(1)引物液:含有上述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，所述引物液中各引物的浓度分别为48?52μΜ外引物1、48?52μΜ外引物2，48?52μΜ内引物1、48?52μΜ内引物2;
(2)反应液:含有12mM dNTPs、10 X Isothermal Amplificat1n反应缓冲液、150mMMgS04水溶液，所述dNTPs、反应缓冲液和MgS04水溶液的体积比是7?9:4?6:2;
(3)DNA聚合酶:DNA聚合酶的浓度为7?9UAU;
(4)对照:阳性对照为耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
[0011]作为本发明进一步的方案:所述弓丨物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物1、50μΜ内引物2。
[0012]作为本发明进一步的方案:所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶的浓度为8υ/μ1。
[0013]作为本发明进一步的方案:所述反应液中，1 2mM dNTP: 10 X IsothermalAmp 1 if i cat 1n反应缓冲液:150mM MgS(k水溶液的体积比为8:5:2。
[0014]作为本发明进一步的方案:还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料Calcein。
[0015]作为本发明进一步的方案:还含有荧光指示剂，所述荧光指示剂为SYT0-9。
[0016]利用所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品 DNA;
2)恒温检测反应:在PCR管中配制反应体系:弓I物液1.8μ1，反应液15.2μ1，DNA聚合酶1μ1，待检DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μ1;设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混勾后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min;
3)结果判断:通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
[0017]利用所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品 DNA;
2)恒温检测反应:在200μ1PCR管中配制反应体系:引物液1.8μ1，反应液15.2yl，DNA聚合酶Ιμ?，待检DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μ1;设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混勾后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min;
3)结果判断:在上述PCR管中加入1?2μ1显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
[0018]利用所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品 DNA;
2)恒温检测反应:在200μ1PCR管中配制反应体系:引物液1.8μ1，反应液15.2 μΙ,?ΝΑ聚合酶Ιμ?，荧光指示剂SYT0-9 Ιμ?，待检DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free DistilledWater补齐到25μ1 ；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪在60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min ；
3)结果判断:根据是否出现S型扩增曲线判断扩增结果。
[0019]其中，CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA的方法为:
(1)取转基因大豆M0N89788约lOOmg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反复研磨3次；
(2)加入1.5ml 预热至65°C的CTAB提取缓冲液(100 mM Tris-HCI ( pH 8.0),1.4 ΜNaCI,20mM EDTA pH 8.0)，加入巯基乙醇20μ1，上下震荡，充分混合，65°C保温30min，每隔lOmin颠倒混勾一次；
(3)约12000rpm离心lOmin，转移上清至新的离心管，