酿酒酵母代谢工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸生产水平的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术、代谢工程领域，涉及一种通过代谢途径改造来提高酿酒 酵母菌株生产s-腺苷-L-蛋氨酸能力的方法。
【背景技术】
[0002] S-腺苷-L-蛋氨酸，简称SAM，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中，是一种重要 的代谢中间产物。作为胞内甲基供体，SAM在核酸、蛋白质以及脂类等分子的甲基化修饰中 扮演重要角色。同时，SAM还参与胞内的转硫基反应以及聚胺的合成等重要生化反应。SAM也 是一种非常有价值的医药分子，在治疗肝病、抑郁症和风湿性关节炎中发挥重要作用。
[0003] SAM在胞内是经过腺苷蛋氨酸合成酶催化，由蛋氨酸和ATP结合生成的。研究标明， 胞质内过量的SAM对细胞毒害作用非常强，SAM不能在细胞液中大量贮存。然而，酵母一类微 生物却能在富含蛋氨酸的环境中大量合成并积累SAM，这是因为酵母细胞的液泡中含有大 量的带负电荷的聚磷酸盐，这些聚磷酸盐能固定住带正电荷的SAM。因此，酵母成为了工业 生产SAM的首选宿主。
[0004] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有遗传背景清楚、食品级安全、抗逆性 强以及发酵条件容易控制等许多优良特性，因此被广泛用作食品、医药以及化工工业的生 产菌株。尽管天然的酿酒酵母生产腺苷蛋氨酸能力已经很强，但还是不能满足市场日益增 长的需求，寻求更多途径继续提高腺苷蛋氨酸的产量的任务迫在眉睫。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为满足腺苷蛋氨酸日益增长的工业生产需求，提供一种酿酒酵母 代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法。
[0006] 酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，对酿 酒酵母菌株腺苷蛋氨酸脱羧途径进行了基因敲除。
[0007] 进一步地，所述对酿酒酵母菌株腺苷蛋氨酸脱羧途径的敲除是通过敲除酿酒酵母 菌株染色体上腺苷蛋氨酸脱羧酶基因 SPE2来实现的。
[0008] 进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株，在酿酒酵母单倍体菌株 中实施所述敲除包括以下步骤： 步骤1:设计含有SPE2基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯 化得到SPE2基因的敲除框； 步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中， 通过G418平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证。
[0009] 进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，在酿酒酵母双倍体菌株 中实施所述敲除包括以下步骤： 步骤1:设计含有SPE2基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯 化得到SPE2基因的敲除框； 步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中， 通过G418平板筛选以及PCR验证，得到一条SPE2等位基因被置换的杂合子； 步骤3:将步骤2得到的杂合子置于产孢培养基上培养至孢子大量产生，收集孢子，溶解 孢子子囊壁后，分离孢子； 步骤4:将步骤3得到的分离孢子置于G418平板上培养至菌落生成，挑取单菌落进行PCR 验证。
[0010] 进一步地，所述步骤中设计含有SPE2基因同源臂的引物，该引物序列为： 上游引物 SPE2-up(5'-3'）： CATATAGTGTCTTACGCAAATAGGCGGACCATAGAATGACTGTCACCATACAGCTGAAGCTTCGTACGC 下游引物SPE2-down (5 ' -3 '）： ACAAGCGGGTTAAACTACATTAGTTATGAGTGCTAGAAAGCAAGCGAAGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG； PCR验证的引物序列为： 上游引物 SPE2-A: 5 ' -CGCTCCTTGCATCAACTCTT-3 ' 下游引物SPE2-D: 5 ' -GCGGCTAAACTCCCTTAGCT-3 '。
[0011] 为实现上述目的，本发明还可采用以下技术方案： 酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，在同一酿 酒酵母菌株中对糖原合成途径和腺苷蛋氨酸脱羧途径两个途径进行敲除。
[0012] 进一步地，在同一酿酒酵母菌株中将糖原支链酶基因 GLC3和腺苷蛋氨酸脱羧酶基 因 SPE2两个基因进行敲除。
[0013] 进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，以在酿酒酵母双倍体中 先进行GLC3敲除然后进行SPE2敲除，敲除米用以下步骤： 步骤1:以pUG6为模版PCR模版，构建GLC3敲除框，转化至酿酒酵母双倍体菌株中，经过 G418平板筛选出一条GLC3等位基因被替换的杂合子； 步骤2:将步骤1得到的杂合子经过产孢培养基培养大量生成子囊孢子，所得子囊孢子 经过溶壁处理，得到分散孢子;分散孢子置于G418平板筛选，即可得到GLC3被敲除的纯合子 单菌落； 步骤3:将步骤2得到的GLC3被敲除的纯合子进行标记回收； 步骤4:在标记回收了的GLC3敲除纯合子上继续进行SPE2敲除和标记回收，最终得到 GLC3和SPE2两个基因都敲除掉的纯合子。
[0014] 进一步地，上述步骤3中将步骤2得到的进行标记回收，该步骤具体包含以下步骤： 步骤1:将PSH65质粒通过LiAC/PEG转化到GLC3被敲除的纯合子中，用博来霉素抗性进 行筛选； 步骤2:将步骤1所得到的博来霉素抗性菌株接种到YPG中，半乳糖存在条件下诱导菌株 合成Cre重组酶，从而导致染色体上G418抗性基因脱落； 步骤3:将步骤3所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到 Yro和含有G418 Yro平板的对应位置上，30°C下恒温培养两天； 步骤4:将YPD上生长而G418 YPD上不生长的菌落挑出来，提基因组，进行PCR验证； 上述步骤4中的标记回收具体包含以下步骤： 步骤1:将PSH65质粒通过LiAC/PEG转化到GLC3和SPE2被敲除的纯合子中，用博来霉素 抗性进行筛选； 步骤2:将步骤1所得到的博来霉素抗性菌株接种到YPG中，半乳糖存在条件下诱导菌株 合成Cre重组酶，从而导致染色体上G418抗性基因脱落； 步骤3:将步骤3所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到 Yro和含有G418 Yro平板的对应位置上，30°C下恒温培养两天； 步骤4:将YPD上生长而G418 YPD上不生长的菌落挑出来，提基因组，进行PCR验证。
[0015] 本发明中，先进行GLC3敲除然后标记回收，再进行SPE2敲除和标记回收，得到GLC3 和SPE2都敲除的菌株，或者，先敲除SPE2基因后进行标记回收，再敲除GLC3基因后进行标记 回收，得到的GLC3和SPE2都敲除的菌株，对提高酿酒酵母菌株生产腺苷蛋氨酸产量都有效。
[0016] 腺苷蛋氨酸合成的直接底物只有蛋氨酸和三磷酸腺苷ATP，添加外源蛋氨酸能快 速加剧酿酒酵母合成SAM，是最直接最有效率的提高SAM产量的方法。然而，SAM在胞内大量 合成的同时，也被大量消耗，只有一部分被转移到液泡中存储起来。已有大量研究报道，过 量表达腺苷蛋氨酸合成酶也是提高SAM合成效率的有效手段，可通过代谢改造降低SAM消耗 的研究报道却几乎没有。事实上，减少胞内SAM的损耗，对提高酿酒酵母胞内积累SAM效率也 是十分重要的。
[0017]腺苷蛋氨酸胞内降解途径主要有两条：一条是去甲基途径，细胞依赖此途径对 DNA、蛋白质等分子进行甲级修饰，是无可取代的必需途径;另一条是脱羧基途径，细胞利用 此途径合成精胺、亚精胺以及聚胺，这一类胺类物质对细胞生长代谢有调节作用。研究报 道，敲除了 SAM脱羧途径的关键酶类，细胞不能在没有外源添加胺类物质的培养基上生存， 却能在此胺类物质少量补充的培养基上正常生长。由此启发，敲掉SAM脱羧酶