5min， 弃上清；
[0051 ] (6)自然风干RNA沉淀约5-10min，用30-40yL的RNase-free水常温溶解RNA;
[0052] (7)取lyL稀释100倍后，5yL用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，剩余用于分光光度 计检测总RNA浓度和纯度，-80°C保存备用。
[0053] 步骤二，样品RNA的反转录。
[0054]以步骤一中提取的RNA为模板，应用茎环荧光定量PCR试剂盒中提供的反转录系统 反转录合成cDNA。首先去除RNA中基因组DNA污染，反应体系共10yL，其中，5Xg DNA Eraser Buffer 2yL，gDNA Eraser lyL，总RNA 0.5_1.0yg，补加 RNase-free水至 10yL。反应条件为： 42°C2min，反应结束后，反应液置于4°C保存，用于下一步的反转录。反转录反应体系共20μ L，其中，5XPrimer scriptBufTer4yL，Primer scriptRT Enzyme Mix I lyL，莖环引物（10 μΜ) lyL，去DNA污染的反应液10yL，RNase-free水4yL。反转录反应条件为：42°C 15min，85°C 5s。反应结束后的cDNA置于-20°C保存备用。
[0055] 步骤三，实时荧光定量PCR反应
[0056]将步骤二中的cDNA用ddH20稀释8倍后用于实时荧光定量PCR反应中的模板。每个 反应作3个重复。反应体系为：2XSYBR Premix Ex Taq 10yL，10ymol/L bm〇-miR-277-5p正 向引物0 · 4yL，10ymol/L bm〇-miR-277-5p反向引物0 · 4yL，模板lyL，ddH20 8 · 2yL，终体积20 yL。反应条件为:95°C预变性111^11;95°(3158,60°(311^11，40个循环。以家蚕8111]6基因为内参， 用2_^&相对定量法分析bm〇-miR-277-5p在感染BmNPV的家蚕和正常家蚕中的相对转录水 平。结果如图1所示。bm〇-miR-277-5p在感染BmNPV的家蚕中的表达水平显著高于正常家蚕 中的表达水平。
[0057] 实施例2bm〇-miR-277-5p的靶基因生物学预测和实验室验证 [0058] 步骤一，用RNAHybrid生物学软件预测bm〇-miR-277-5p的靶基因。设定种子区域完 全配对及最小自由能为_20kcal/mol为筛选标准，预测得到bm〇-miR-277-5p的革E1基因为家 蚕DNA胞嘧啶甲基转移酶，如图2所示。
[0059] 家香 DNA 胞啼啶甲基转移酶基因（13〇11^5^111〇1'10^〇71:〇8；[116-5methyl transferase，Dnmt2)的genebank 登陆号为ΝΜ_001043469 · 1，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0060] 步骤二，双荧光素酶报告基因系统验证靶基因，载体构建的示意图见图3,具体流 程如下：
[0061 ] (1)化学合成靶基因 Dnmt23'UTR及突变片段，Dnmt23'UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，突变片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，合成时在目的片段两端加上Nhe I(GCTAGC)/Sal I(GTCGAC)酶切位点。合成的基因片段平端克隆到pUC57载体，然后测序验 证。
[0062] (2)目的片段载体双酶切：37°C用Sal I和Nhe I酶切目的载体片断2h，l%琼脂糖 凝胶电泳，使用凯杰(QIAGEN)公司的凝胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回 收酶切产物。
[0063] (3) pmirGLO载体双酶切：37°C双酶切过夜；1 %琼脂糖凝胶电泳，使用QIAGEN公司 的QIAquick Gel Extraction Kit回收线性化的载体片段。
[0064] (4)目的片段与pmirGLO载体连接:在无菌的0.5ml试管配制以下20yL反应体系：线 性化的pmirGLO载体，2yL(约1 OOng);目的DNA片段，5yL(约300ng); 10 X T4DNA连接酶缓冲液 (10 X T4DNALigaseBuffer)，2yL; T4DNA连接酶（T4DNALigase)，lyL; ddH20，10yL。16°C连接 过夜。
[0065] (5)连接产物的转化
[0066] 1)冰浴中将5yL连接产物分别加入至100yL DH5a感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰 浴30min。
[0067] 2)42°C 水浴热击 90s。
[0068] 3)快速将管转移至冰浴中，冰浴3min。
[0069] 4)分别加入200yL LB培养基，混匀，37°C，200rpm振荡培养lh。
[0070] 5)将菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平 板，转移入37°C生化培养箱过夜培养。
[0071] (6)阳性克隆的筛选及测序验证
[0072]挑取单菌落克隆并经Sall+Nhel双酶切电泳鉴定，同时接种含氨苄青霉素的LB液 体培养基培养8h。克隆经双酶切电泳鉴定后测序，与预期序列一致的克隆保留，接种含氨苄 青霉素的LB液体培养基20mL培养12h后提取质粒DNA，获得含化学合成靶基因 Dnmt23'UTR的 重组质粒口111；^611)-〇1111^2(即口111；[411)-01111^2-3'17110以及含化学合成革巴基因01111^2突变片段 的重组质粒pmirGL0-Dnmt2_mut (即pmirGL0-Dnmt2_3 ' UTR-mut) 0 [0073] (7)细胞转染
[0074] 化学合成bm〇-miR-277-5p模拟物及阴性对照物(Ν〇<^πι〇-π?Κ-277-5ρ模拟物核苷 酸序列（SEQIDN0·8和SEQIDN0·9)为：
[0075] 正义链（SEQ ID N0.8):5'-UCGUGCCAGGAGUGCGUUUGCGU-3'
[0076] 反义链（SEQ ID N0.9):5'-GCAAACGCACUCCUGGCACGAUU-3'
[0077] NC核苷酸序列（SEQ ID Ν0· 10和SEQ ID Ν0· 11)为：
[0078] 正义链（SEQ ID N0.10):5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'
[0079] 反义链（SEQ ID N0.11):5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'
[0080] 以lipofectamineTM 2000(简称lipo2000)转染48孔板。转染前一天，接种适当数 量的293T细胞于48孔培养板中，每孔加入不含抗生素的1640培养基，使转染时的细胞密度 能够达到70 %~80 %。共设置以下组别，每组3个平行孔:pmirGL〇-Dnmt2、pmirGL〇-Dnmt2+ miR-277-5p、pmirGL〇-Dnmt2+NC、pmirGL〇-Dnmt2-mut、pmirGL〇-Dnmt2-mut+miR-277-5p、 miR-277_5p-mut+NC。对于每个转染样品，按如下步骤准备质粒-lipo2000混合液：
[0081 ] 1)稀释质粒：用25yL不含血清培养基稀释100ng pmirGL〇-Dnmt2等载体，得溶液 VI，用25yL不含血清培养基分别稀释100ng miR-277-5p模拟物等，得溶液V2，轻轻混匀； [0082] 2)稀释lipo2000:用25yL不含血清培养基稀释lipo2000,轻轻混匀并室温孵育 5min，得V3;
[0083] 3)根据设置的组别，将VI与V3,或者V1+V2与V3轻轻混匀，室温孵育20min;
[0084] 4)将质粒-lipo 2000混合液（即步骤3)的混合液)加入含有细胞和培养基的48孔 板中，轻轻摇匀；
[0085] 5)将培养板置于37°C的⑶2培养箱中培养4~6h后，将孔里含有质粒-lipo2000混 合液的培养液移去，更换新鲜培养基培养到48h。
[0086] (8)荧光素酶活性测定
[0087] 1)将细胞用细胞裂解液裂解后，取5yL细胞裂解液与海肾荧光素酶缓冲液及底物5 yL(按Promega双荧光报告系统测量试剂盒说明）混匀测量荧光强度，然后加入萤火虫荧光 素酶反应缓冲液及腔肠素底物5yL，混匀再次测得萤火虫荧光素酶活性。
[0088] 2)将每个样品按照海肾荧光素酶活性进行均一化处理，比较萤火虫荧光素酶活性 并绘制图表。实验结果见图4。结果表明，bm〇-miR-277-5p对pmirGL0-Dnmt2(p<0.05)的荧 光活性有显著抑制作用。
【主权项】
1. 一种bm〇-miR-277-5p在制备检测家蚕核型多角体病毒感染的试剂盒中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，家蚕为幼虫。3. -种检测家蚕核型多角体病毒感染的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测家蚕 中bm〇-miR-277-5p的表达水平。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测家蚕bmo-miR-277-5p的荧光定量PCR扩增的引物以及反转录引物。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR扩增的引物包括如SEQID NO.4所示碱基序列的正向引物和如SEQIDNO.5所示碱基序列的反向引物。6. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的反转录引物为如SEQIDNO.3所 示碱基序列的茎环引物。7. -种bm〇-miR-277-5p在抑制基因表达中的应用，其特征在于，所述的基因转录后的 mRNA具有如SEQID从).12所示序列的3'17^。8. 根据如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的基因为家蚕DNA胞嘧啶甲基转移 酶基因。
【专利摘要】本发明公开了一种与家蚕核型多角体病毒感染相关的microRNA的应用。所述的应用为bmo-miR-277-5p在制备检测家蚕核型多角体病毒感染的试剂盒中的应用，或者所述的应用为bmo-miR-277-5p在抑制基因表达中的应用，所述的基因转录后的mRNA具有如SEQ？ID？NO.12所示序列的3’UTR。本发明开拓了家蚕microRNA特别是bmo-miR-277-5p的新用途，可为研究家蚕与核型多角体病毒的互作机制提供新的研究方向，同时为家蚕核型多角体病毒的诊断、防治提供新的思路。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105483269
【申请号】CN201610057131
【发明人】吴萍, 郭锡杰, 李龙, 陈涛
【申请人】江苏科技大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月27日