烈性传染病病原体检测引物组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及烈性传染病病原体检测技术领域，特别是烈性传染病病原体检测引物 组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 2014年西非地区爆发了有史以来最为严重的埃博拉疫情，并第一次走出非洲，扩 散至欧美等发达国家，造成11000多人死亡。中非友谊源远流长，经济贸易和文化交流频繁 密切，因此，埃博拉疫情输入的风险很大。疫情发生后，中国政府不仅第一时间向非洲国家 提供了大量物资和技术援助，还专门派出了医疗卫生专家，组成检测队和医疗队帮助当地 对抗埃博拉疫情。
[0003] 拉萨热(Lassa fever)是发生在西非的一种病程1-4周的人畜共通疾病。其病源体 为拉萨热病毒，因治疗难度和传染性被列为生物安全第四级(Biosafety Level 4)病毒。此 病毒为一种属于沙粒病毒科的单链核糖核酸(RNA)病毒。在几内亚、利比里亚、塞拉利昂和 尼日利亚部分地区流行，但在其它西非国家也可能存在。
[0004] 马尔堡出血热(Marburg hemorrhagic fever)是由来自与引起埃博拉出血热的病 毒同一科的一种病毒即马尔堡病毒引起的严重高致命性疾病。这些病毒属于已知感染人的 最烈性病原体。
[0005] 裂谷热(rift valley fever)是由裂谷热病毒引起的，经蚊类媒介或接触传播的 急性病毒性感染病。临床上以发热、头痛、肌痛、衰竭、畏光及白细胞减少为特征。
[0006] 黄热病(yellow fever)是黄热病毒所致的急性传染病，主要经伊蚊传播。重型患 者有发热、黄疸和蛋白尿等。主要媒介在城市是埃及伊蚊，在农村为趋血蚊和非洲伊蚊，传 播途径是经蚊的叮咬。
[0007] 基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒（CHIKV，为单股RNA病毒）引起，经伊蚊传播，以发 热、皮疹及关节疼痛为主要特征的急性传染病。
[0008] 发展针对埃博拉病毒等多种烈性传染病病原的快速检测技术是及时发现传染源， 实施及时有效隔离和对症治疗的关键。目前主要采用荧光定量PCR技术进行检测，优点是快 速、检测结果较准确，但荧光定量PCR技术操作比较繁琐，需要依赖不便于携带的大型仪器， 这不利于在现场条件下开展检测。此外，对于与埃博拉病毒感染症状相似的病原体所致感 染需要再次确诊，才能够得到有效救治。所以对于病源检测的灵敏度和特异性等具有较高 要求。
【发明内容】
[0009] 本发明是针对生物防控及新发突发传染病防控等领域特殊病原体的现场快速多 通道检测的迫切需求而研发的，目的在于提供一种针对上述烈性传染病病原体的检测引物 组，以及包括该引物组的试剂盒，能够方便快速且准确地检出样本中的病原体种类，特异性 和灵敏度极佳。
[0010] 本发明提供的烈性传染病病原体检测引物组，包括埃博拉病毒RT-LAMP引物、拉萨 热病毒RT-LAMP引物、马尔堡病毒RT-LAMP引物、裂谷热病毒RT-LAMP引物、黄热病毒RT-LAMP 引物和基孔肯雅热病毒RT-LAMP引物中的至少一种;具体核苷酸序列如下：
[0011] 埃博拉病毒RT-LAMP引物：
[0012] Ebov-F3：SEQ ID N0：1,
[0013] Ebov-B3：SEQ ID NO：2,
[0014] Ebov-FIP：SEQ ID NO：3,
[0015] Ebov-BIP：SEQ ID N0：4；
[0016] 拉萨热病毒RT-LAMP引物：
[0017] Lassa-F3：SEQ ID NO：5,
[0018] Lassa-B3：SEQ ID N0：6,
[0019] Lassa-FIP：SEQ ID N0：7,
[0020] Lassa-BIP：SEQ ID N0：8,
[0021] Lassa-LF：SEQ ID N0：9,
[0022] Lassa-LB：SEQ ID NO：10；
[0023] 马尔堡病毒RT-LAMP引物：
[0024] Marburg-F3：SEQ ID NO：11,
[0025] Marburg-B3：SEQ ID NO：12,
[0026] Marburg-FIP：SEQ ID NO：13,
[0027] Marburg-BIP：SEQ ID NO：14,
[0028] Marburg-LF：SEQ ID NO：15,
[0029] Marburg-LB：SEQ ID NO：16；
[0030] 裂谷热病毒RT-LAMP引物：
[0031] RVFV-F3：SEQ ID NO：17,
[0032] RVFV-B3：SEQ ID NO：18,
[0033] RVFV-FIP：SEQ ID NO：19,
[0034] RVFV-BIP：SEQ ID NO：20,
[0035] RVFV-LF：SEQ ID NO：21,
[0036] RVFV-LB：SEQ ID NO：22；
[0037] 黄热病毒RT-LAMP引物：
[0038] yellow fever-F3：SEQ ID NO：23,
[0039] yellow fever-B3：SEQ ID NO：24,
[0040] yellow fever-FIP：SEQ ID NO：25,
[0041] yellow fever-BIP：SEQ ID NO：26,
[0042] yellow fever-LF：SEQ ID NO：27,
[0043] yellow fever-LB：SEQ ID NO：28；
[0044] 基孔肯亚热病毒RT-LAMP引物：
[0045] CHIK-F3：SEQ ID NO：29,
[0046] CHIK-B3：SEQ ID NO：30,
[0047] CHIK-FIP：SEQ ID NO：31,
[0048] CHIK-BIP：SEQ ID N0：32〇
[0049] 本发明针对上述烈性传染病病原的相对保守序列分别设计相应的RT-LAMP引物， 其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(LB、LP)。扩增反应 只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些 特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。
[0050] 本发明提供的一种烈性传染病病原体检测试剂盒，其包括以上所述的烈性传染病 病原体检测引物组。
[0051] 优选地，上述烈性传染病病原体检测试剂盒，还包括检测液，所述检测液中包括 LAMP缓冲液、dNTPs、有链置换特性的DNA聚合酶、反转录酶、Betaine、MgS〇4、HNB和ddH20。 [00 52] Betaine又称甜菜碱，三甲铵乙内酯，本发明检测液中加入Betaine用以调节解链 温度。
[0053] HNB即羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝是一种钙镁离子指示剂，在反应中镁离子与dNTP反 应形成焦磷酸镁，消耗镁离子，羟基萘酚蓝会从紫罗兰色变为蓝色。检测液中加入反转录 酶，省略了单独的RT-PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性 过程，减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性，同时RT-PCR也 缩短了检测所需的时间。
[0054] 优选地，上述烈性传染病病原体检测试剂盒中，检测液中各成分的浓度为： 有链置換特性的DNA聚合酶0、4TJ/mL, 及转彔酶 0.5'U7uLj
[0055] Betaine 100 m?K4/Lj MgS〇4 7.5mm oI/Li
[0056] 优选地，以上任一所述的烈性传染病病原体检测试剂盒，还包括用于现场检测的 微流控芯片，该芯片包括封接在一起的基板和盖片，基板上设有多个检测单元，每个检测单 元由依次连通的进样通道、反应池和连接通道组成，盖片上设有进样孔和排气孔，进样孔对 应于进样通道的末端（即进样通道远离反应池的一端），排气孔对应于连接通道的末端（即 连接通道远离反应池的一端），排气孔的内部或表面有疏水透气介质。
[0057] 其中，微流控芯片的材料可以为多种，例如高分子化合物、金属、玻璃、石英、硅、陶 瓷、高分子化合物、橡胶和硅铝酸盐化合物等，而以聚碳酸酯、聚丙烯或聚乙烯醇等高分子 材料为最佳，附着效果最好。疏水透气介质可以是聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯或聚丙烯等。
[0058] 优选地，上述烈性传染病病原体检测试剂盒中，所述反应池中附着有权利要求1所 述的烈性传染病病原体检测引物组，一个反应池对应于一种病毒的RT-LAMP引物。
[0059]优选地，上述烈性传染病病原体检测试剂盒中，一个反应池内的RT-LAMP引物量 为:F3与B3均5pmol，BIP与FIP均40pmol，LP与LB均20pmol。
[0060]本发明还提供了以上所述烈性传染病病原体检测试剂盒的使用方法，是将待检测 样品提取RNA，与检测液混合后，滴入进样孔，待其移动到各个反应池后用不透水不透气的 封口膜封住进样孔和排气孔，将芯片在63°C环境下反应1小时，然后85°C灭活5分钟