用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法
【专利说明】用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法
【背景技术】
[0001] 1.发明领域
[0002] 本发明涉及具有改进的腐胺生产力的重组微生物和使用其以高产率生产腐胺的 方法。
[0003] 2.相关技术的描述
[0004] 多胺比如亚精胺、精胺等等存在于大多数活细胞中,并且腐胺(或1,4_丁二胺)用 作亚精胺和精胺代谢中的前体。腐胺在革兰氏阴性菌或真菌中发现,并且其在各种物种中 以高浓度存在,这表明其在微生物的代谢途径中具有重要作用。
[0005] -般而言,腐胺是聚胺尼龙_4、6-一其通过与己二酸反应产生一一合成中的重要 原料。腐胺主要通过自丙烯通过丙烯腈和琥珀腈的化学合成产生。该化学合成是三步法,其 包括催化氧化反应、使用氰化物化合物的反应和使用高压氢的加氢反应。因为该化学合成 不是环境友好的并且也消耗大量的能量,导致石油耗竭,所以存在问题。因此,需要开发涉 及生物质利用的更环境友好的和能量有效的方法用于腐胺生产。
[0006] 在微生物体内,腐胺的生物合成途径与从谷氨酸到鸟氨酸合成的精氨酸合成路线 相同。腐胺可以自微生物通过两条途径生物合成。在一条途径中,作为中间体的鸟氨酸脱羧 基以合成腐胺。在另一条途径中,通过自鸟氨酸合成的精氨酸脱羧反应产生胍基丁胺,然后 自胍基丁胺合成腐胺(Morris等,J Biol.Chem.241:13,3129-3135,1996)。这两条途径产生 代谢所需要的能量或者使细胞具有对氧化应激的抗性。
[0007] 作为使用微生物生产腐胺的方法,通过转化大肠杆菌和棒状杆菌以高浓度生产腐 胺的方法已经被报道(国际专利公开号W006/005603;国际专利公开号W009/125924;Qian ZD等,Biotechnol.Bioeng.104:4,651-662,2009;Schneider等, Appl .Microbiol · Biotechnol · 88 : 4,859-868,2010;Schneider等, Appl .Microbiol .Biotechnol ·91:17-30,2011)。例如,W009/125924公开了通过增强鸟氨酸 生物合成途径而不是失活参与在大肠杆菌中存在的腐胺的降解和利用的途径和失活作为 腐胺的前体的鸟氨酸到精氨酸的转化,来以高产率生产腐胺的方法。此外,Schneider (2010)公开了通过将能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质引入不具有腐胺生产力的棒状杆菌 属某种菌株和增强能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质进入不具有腐胺生产力的棒状杆菌属 某种菌株,以高浓度生产腐胺的方法。
[0008] 而且,对在大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞中腐胺运载体的研究已经积极地进行 (K Igarashi,Plant Physiol .Biochem. 48: 506-512,2010)。大肠杆菌的腐胺摄取经由4种 途径发生;由ATP水解作用驱动的potABCD或potFGHI,和作为H+同向转运体(symporter)的 potE和puu途径的puuP。关于参与腐胺摄取的这些复合体的Km值,PotFGHI、potAB⑶、potE和 puuP的Km值分别为0.5mM、1.5mM、1.8mM和3.7mM。在这四种腐胺摄取途径中,potFGHI复合体 被认为是最合适的。此外,P〇tE运载体具有摄取和分泌腐胺二者的功能。腐胺在中性pH下与 质子一起被输入细胞中。然而,由于腐胺合酶(speF)在酸性pH条件下表达,所以细胞外鸟氨 酸的细胞内摄取和在细胞内合成的腐胺的细胞外分泌同时发生(K u r i h a r a等, J.Bacteriology 191:8,2776-2782,2009)〇
[0009] 酵母中已知的腐胺输出蛋白(exporter)是TP01和TP04。这些氨基酸序列与芽孢杆 菌多药运载体Bit的氨基酸序列非常相似。
[0010]这两种输出蛋白与大肠杆菌中的P〇tE共享特征,并且它们在碱性条件下具有输入 腐胺、亚精胺和精胺的功能并且在酸性条件下输出它们。此外,过表达TP05基因的酵母细胞 对120mM腐胺具有抗性,反之破坏TP05基因的突变体对90mM腐胺敏感(Tachihara等, J.Biological Chemistry,280(13):12637-12642,2005)〇
[0011] 动物细胞中腐胺的合成和降解,以及摄取和分泌以不同的方式调控。虽然对聚胺 分泌的研究还没有在动物细胞以及大肠杆菌或酵母中进行,但是有报道SLC3A2(精氨酸/二 胺输出蛋白)在结肠上皮细胞中起将精氨酸输入细胞并输出腐胺、乙酰基亚精胺和乙酰基 精胺的作用。然而,没有关于在植物细胞中摄取和输出腐胺的报道(Igarashi等,Plant Physiol.&Biochem.48:506-512,2010)〇
[0012] 另一方面,由于棒状杆菌属某种微生物不具有腐胺生物合成途径,所以还没有进 行关于腐胺输出的研究。根据最近的报道,通过在产生尸胺的菌株中过表达cg2983膜蛋白 恢复细胞生长和增强尸胺生产力(Kind等,Metabolic Engineering 13:617-627,2011) 〇
[0013] 然而,还没有关于腐胺输出蛋白和腐胺生产力或生产腐胺的微生物的生长之间的 关联的报道。在以上的文献中,没有提及关于cg2983膜蛋白和腐胺的输出能力之间的关联。 [0014]在该背景下,本发明人已经进行了许多努力以开发能够以更高产率生产腐胺的菌 株。结果,NCg 12522功能揭不为腐胺生广囷株 棒状杆囷属某种微生物 中的腐胺输 出蛋白,并且可以通过与NCgl2522内源活性相比增强其活性以高产率生产腐胺。此外,培养 基中腐胺的量可以通过在具有腐胺合成途径的大肠杆菌中表达NCgl2522增加,并且因此本 发明人表明NCgl2522在大肠杆菌中也起腐胺输出蛋白的作用,从而完成本发明。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是提供被修饰以具有增强的NCgl2522活性从而以高产率生产腐胺 的重组微生物。
[0016] 本发明的另一目的是提供使用该微生物以高产率生产腐胺的方法。
【附图说明】
[0017] 图1是表明NCgl2522包含在根据本发明的克隆(B19)中的图,所述克隆(B19)最终 选自引入有棒状杆菌属染色体文库的转化的菌落;和
[0018] 图2是评估根据本发明的NCgl2522缺失的或增强的重组菌株的腐胺抗性的结果。
[0019] 1:KCCM11240P
[0020] 2:KCCM11240P ANCgl2522
[0021] 3:KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522
【具体实施方式】
[0022] 在实现以上目标的一方面中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其被修饰以 增强具有由SEQ ID N0:21或23表示的氨基酸序列的蛋白质的活性。
[0023] 在一个具体的实施方式中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其中该微生物 被进一步修饰以与其内源活性相比,具有减弱活性的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和参与 谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221),并且所述微生物被引入具有鸟氨酸脱羧酶(0DC)活性。
[0024] 在另一具体的实施方式中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其中鸟氨酸氨 甲酰基转移酶(ArgF)具有由SEQ ID N0: 29表示的氨基酸序列,参与谷氨酸输出的蛋白质 (NCgll221)具有由SEQ ID N0:30表示的氨基酸序列,并且鸟氨酸脱羧酶(0DC)具有由SEQ ID N0:33表示的氨基酸序列。
[0025] 在仍另一【具体实施方式】中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其中该微生物 进一步修饰为与其内源活性相比,具有增强活性的乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶 (ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨 酸氨基转移酶(ArgD)。
[0026] 在仍另一具体的实施方式中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其中乙酰基-γ_谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨 酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)分别具有由SEQ ID N0:25、26、27和28表示 的氨基酸序列。
[0027] 在仍另一【具体实施方式】中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其中微生物的 乙酰转移酶(NCgl 1469)活性进一步被减弱。
[0028] 在仍另一【具体实施方式】中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其中乙酰转移 酶具有由SEQ ID N0:31或32表示的氨基酸序列。
[0029] 在仍另一【具体实施方式】中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其中微生物是 埃希式杆菌属某种或棒状杆菌属某种。
[0030] 在仍另一【具体实施方式】中,本发明提供具有腐胺生产力的微生物,其中该微生物 是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
[0031] 在另一方面,本发明提供生产腐胺的方法,其包括以下步骤:培养具有腐胺生产力 的微生物以获得细胞培养物和从培养的微生物或细胞培养物回收腐胺。
[0032]在下文中,将详细地描述本发明。
[0033]本发明提供重组棒状杆菌属某种微生物,其中具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种 微生物被修饰为与其内源活性相比,具有增强的NCgl2522活性,并因此其具有提高的腐胺 生产力。
[0034]如本文所使用,术语"NCgl2522"指的是属于MFS(主要协同转运蛋白超家族)的通 透酶,其是从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032分离的膜蛋白。NCgl2522已知自谷氨酸棒状杆菌输 出二氨基戊烷。在本发明中,NCgl2522被确认起用于将细胞内产生的腐胺细胞外输出的运 载体的作用。基于此事实,本发明提供显示高产率腐胺生产力的重组微生物,其中NCgl2522 被修饰为与其内源活性相比,具有增强的活性,并且因此,增加细胞内产生的腐胺的输出。
[0035] 如本文所使用,术语"内源活性"指的是微生物在其天然状态即没有修饰的状态中 具有的酶的活性,并且"修饰为与内源活性相比具有增强的活性"的意思是与修饰前的相应 酶的活性相比,酶的活性被新引入或进一步提高。
[0036] 在本发明中,"酶活性的增强"包括通过内源基因活性的提高造成的酶活性的提 高、通过内部或外部因素造成的内源基因的扩增、抑制基因表达的调节因子的缺失、基因拷 贝数的增加、通过引入外源基因或修饰表达调控序列一一具体而言,基因内的启动子的置 换或修饰以及突变一一造成的活性的增加,以及其本身酶活性的引入或提高以实现超越内 源功能的效果。
[0037]在本发明中,"修饰为与内源活性相比具有增强的活性"意思是与操纵前的微生物 的活性相比,操纵后微生物的活性增加,所述操纵比如引入显示活性的基因,或增加基因拷 贝数,缺失抑制基因表达的调控因子或修饰表达调控序列,例如,使用改进的启动子。
[0038]其活性通过本发明增加的NCgl2522可以是但不具体地限于如此蛋白质,所述蛋白 质具有SEQ ID N0:21或23的氨基酸序列或具有70%或更多与其同源性、优选地80%或更多 与其同源性、更优选地90%或更多与其同源性、更优选地95%或更多与其同源性、更优选地 98%或更多与其同源性和最优选地99%或更多与其同