高密度脂蛋白中的胆固醇测定方法和该方法中使用的试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及简便且精确地测定高密度脂蛋白中的胆固醇的方法和该方法中使用 的试剂。
【背景技术】
[0002] 作为生物体主要的脂质的胆固醇、中性脂肪（以下，有时称为甘油三酯或者TG)和 磷脂在血液中与载脂蛋白一起形成脂蛋白而存在。该脂蛋白，根据物理性状的不同，分为乳 糜微粒、极低密度脂蛋白（以下，有时称为VLDL)、低密度脂蛋白（以下，有时称为LDL)、高密 度脂蛋白（以下，有时称为HDL)等。已知其中的HDL因为从生物体中的各组织接受胆固醇，关 系到积蓄在细胞内的胆固醇的除去作用，是以冠状动脉硬化症为代表的各种动脉硬化症的 危险预防因素。因此，HDL中的胆固醇（以下，有时称为HDL - C)的血中浓度的把握，对动脉硬 化性疾病的发病预知有用而在临床上广泛测定。
[0003] 作为HDL-C的测定方法，不需要将测定试样中的HDL与HDL以外的脂蛋白分离分级 的工序，分类为所谓的均相HDL - C直接测定法（以下，有时称为以往方法）的临床检查用的 试剂大量市售，从而在程序检查中使用（非专利文献1、4)。然而，这些实用化的临床检查用 的方法?试剂也有测定精度方面的问题，特别是在血脂异常检体中，以基准测定法(非专利 文献2、3)测定时的测定值与用各种试剂测定时的测定值的背离在国际上也一直是问题(非 专利文献4)。
[0004] 许多以往方法可以分类为在HDL-C测定前，将HDL以外的脂蛋白中的胆固醇的全 部或者一部分从反应液中消除以使得其不参与HDL - C测定的主反应（以下，有时简称为主 反应)的方法(例如，专利文献1、2);或者，在HDL-C的测定时，HDL以外的脂蛋白中的胆固醇 抑制HDL以外的脂蛋白中的胆固醇的反应以使得其不参与HDL - C测定的主反应的方法(例 如，专利文献3~6)，该以往方法中，概括为HDL以外的脂蛋白VLDL与LDL的性状并不相同，因 此由VLDL引起的测定误差的消除成为课题。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:国际公开第98/26090号小册子 [0008] 专利文献2:国际公开第2000/078999号小册子 [0009] 专利文献3:国际公开第95/24502号小册子 [0010] 专利文献4:国际公开第2004/035816号小册子 [0011] 专利文献5:国际公开第2005/100591号小册子 [0012] 专利文献6:国际公开第2006/118199号小册子 [0013]非专利文献
[0014] 非专利文献l:Clinical Chemistry 47:9 1579 - 1596(2001)
[0015] 非专利文南犬2: European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 29 269 -275(1991)
[0016] 非专利文献3:Clinical Chemistry 45:10 1803 - 1812(1999)
[0017] 非专利文献4:Clinical Chemistry 56:6 977 - 986(2010)
【发明内容】
[0018] 因此，本发明的目的在于，找到即便以像血脂异常症这样的特殊的病症的患者检 体为测定试样时，也能够提高与DCM(指定比较法，Designated Comparison Method)等基准 测定法的测定值的一致性的化合物，提供利用该化合物的HDL-C测定方法。
[0019] 本发明人等对上述课题进行了深入研究，结果发现HDL - C测定时，在#盐和聚阴 离子的存在下将胆固醇氧化酶等胆固醇测定用酶和测定试样混合时，能够大幅抑制该胆固 醇测定用酶对VLDL的反应性，更高精度地测定HDL-C。
[0020] 即，本发明涉及以下内容。
[0021 ] [ 1 ] -种高密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征在于，
[0022] 包含使测定试样与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者与胆固醇酯水解酶和胆 固醇脱氢酶在通式(I)表示的化合物和聚阴离子的存在下反应的工序，
[0023]
[0024] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0025] [2]根据[1]所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0026] [3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基# 盐、三甲基十二烷基I#盐、三甲基十六烷基盐、三乙基辛基#盐、三乙基十二烷基I# 盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基#盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷基I# 盐中的至少1种化合物。
[0027] [4]根据[1]~[3]中任1项所述的方法，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。
[0028] [5]根据[1]~[4]中任1项所述的方法，其中，在进一步存在白蛋白的条件下进行 上述工序。
[0029] [6]根据[1]~[5]中任1项所述的方法，其中，在进一步存在选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物的条件下进行上述工序。
[0030] [7] -种高密度脂蛋白胆固醇测定用试剂，含有下述(a)、（b)和(c): (a)通式(I)表 示的化合物，
[0031]
[0032] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0033] (b)聚阴离子，
[0034] (c)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶
[0035] [8]根据[7]所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0036] [9]根据[7]或者[8]所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基 |奔盐、三甲基十二烷基#盐、三甲基十六烷基I#盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷基 I#盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基I#盐、三丁基十二烷基I#盐和三丁基十六烷基 _盐中的至少1种化合物。
[0037] [10]根据[7]~[9]中任1项所述的试剂，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。
[0038] [11]根据[7]~[10]中任1项所述的试剂，其中，进一步含有白蛋白。
[0039] [12]根据[7]~[11]中任1项所述的试剂，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。
[0040] [13]根据[7]~[12]中任1项所述的试剂，其中，包含第1试剂组和第2试剂组，上述 第1试剂组含有(a)通式(I)和(b)聚阴离子，上述第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和胆固 醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0041] [14]一种试剂盒，在高密度脂蛋白胆固醇测定中使用，含有下述(a)、(b)和(c):
[0042] (a)通式（I)表示的化合物，
[0043]
[0044] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0045] (b)聚阴离子，
[0046] (c)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0047] [15]根据[14]所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链 状的碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0048] [16]根据[14]或者[15]所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基 辛基I#盐、三甲基十二烷基#盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基f奔盐、三乙基十二 烷基I#盐、三乙基十六烷基I聲盐、三丁基辛基I#盐、三丁基十二烷基#盐、以及三丁基 十六烷基I#盐中的至少1种化合物。
[0049] [17]根据[14]~[16]中任1项所述的试剂盒，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸 葡聚糖。
[0050] [18]根据[14]~[17]中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有白蛋白。
[0051] [19]根据[14]~[18]中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基 胺、聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。
[0052] [20]根据[14]~[19]中任1项所述的试剂盒，其中，包含第1试剂组和第2试剂组， 上述第1试剂组含有(a)通式(I)和(b)聚阴离子，上述第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和 胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0053] 根据本发明，不需要对测定试样进行离心分离等前处理，以简便的操作高效地对 HDL - C进行定量。另外，因为能够以少量的测定试样进行特异性测定，所以能够用于各种自 动分析装置，在临床检查领域极其有用。另外，本发明的HDL-C测定因为测定中使用的试剂 的组成是不含有2价金属作为必需成分的组成，所以还具有分析装置不受到负荷的优点。特 别是还具有以往方法中产生测定误差的含有大量的VLDL的检体，例如甘油三酯为高值、总 胆固醇和LDL胆固醇大体为正常值、IV型高血脂症这样的检体的测定精度大幅改善的优点。
【具体实施方式】
[0054] -个实施方式中，本发明提供高密度脂蛋白胆固醇(HDL - C)测定方法。本发明方 法通过在聚阴离子和#盐化合物的存在下，使用公知的胆固醇测定用试剂对含有HDL的测 定试样测定HDL-C来实施。
[0055] 作为供于本发明的方法的测定试样，只要是可能包含HDL、LDL、VLDL和乳糜微粒等 脂蛋白的检体，就可以是任意的，例如，可以举出血清、血浆等体液及其稀释物，不限定于这 止匕 -、〇
[0056]本说明书中，将HDL - C测定中使用的以胆固醇为基质的酶通称为胆固醇测定用 酶。作为胆固醇测定用酶，可举出胆固醇酯水解酶(包含分类为脂肪酶的酶）、胆固醇氧化 酶