inel23购于美国Molecular Probes公司。
[0027] C〇2培养箱(美国Thermo Forma)，超净工作台（中国苏州净化仪器厂），压力蒸汽灭 菌锅(LDZX40BI)(中国上海申安医疗器械厂），TGL-16G型台式高速离心机（中国上海安亭科 学仪器厂），MA260S型电子分析天平（中国上海第二天平仪器厂），自动双重纯水蒸馏器（中 国上海玻璃仪器一厂），Sterivex ΤΜ，0.22μηι无菌针头式过滤器（美国Millipore公司）， XDS-1B光学倒置显微镜（中国重庆光学仪器厂），全自动酶标仪(美国BI0-RID公司），FACS Calibur流式细胞仪(美国BD FACSAria公司）。阢-901型旋涡混合器(江苏海门市麒麟医用 仪器厂）。
[0028]二、试验方法
[0029] 1、细胞培养
[0030] 人急性T淋巴细胞白血病细胞Molt4细胞培养体系:DMEM/F12培养液含10%新生牛 血清，置37°C、体积分数为5%⑶2培养箱，每2-3天传代培养。选用对数生长期、0.2%台盼蓝 拒染率>95 %的细胞进行实验。
[0031] 2、MTT法检测细胞增殖抑制率
[0032] 3X 104mL Molt4细胞接种于96孔培养板，终体积为200yL/孔，每组设5复孔，化合 物（I)设五个浓度分别为2 · 5yg/mL，5yg/mL，10yg/mL，15yg//mL，20yg//mL。置37°C、5 % CO2 培养箱中培养48h、72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL用roS〈ph = 7.4配)20yL，继续孵育4小 时，终止培养，离心，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150yL DMS0，振荡10分钟，使结晶物 充分融解，酶标仪检测吸光值(测定波长570nm，参比波长690nm)，计算各组增殖抑制率。每 次实验重复3次，取其均值。增殖抑制率（％ ) = (1-A实验组/A对照组）X 100%。
[0033] 3、PI单染检测细胞周期
[0034] 2 X 105/mL Mo 114细胞接种于12孔培养板，每孔1800yL，化合物（I)设三个浓度分 别为5yg/mL，1 Oyg/mL 15yg/mL，终体积2500yL，设3复孔。置37°C、5 % C02培养箱中培养48h 后收集细胞，预冷的〇. Olmol/L PBS洗涤细胞2次，用体积分数为70%乙醇4°C固定过夜，离 心去上清，加入PI染色液(含RNA酶），终浓度50yg/mL，避光染色30min，300目尼龙网过滤后 上流式细胞仪分析细胞DNA含量，每个样本随机分析12000个细胞，得各组细胞生长周期比 例，美国BD FAC Sort Cell Quest软件分析处理结果。
[0035] 4、AnnexinV-PI双染测定细胞凋亡比例
[0036] 细胞处理及加药方法均同上，培养48h后，调整细胞浓度为5X106/mL，各组取lmL 细胞，预冷〇.Olmol/L PBS洗涤3次，吸尽上清，加入200yL试剂盒提供的结合缓冲液，重悬细 胞，分别加入lOyLAnnexin V-FITC和5yL，轻轻混匀，4°C避光反应30min，再加入300yL结合 缓冲液，上流式细胞仪检测。Annexin V-FITC+、PI-的细胞群（即LR细胞群）为早期凋亡细 胞。
[0037] 5、统计分析
[0038]以均数士标准差（又±S)表示，应用SPSS13.0统计软件处理，采用完全随机设计的 单因素方差分析(oneiayANOVA)分析组间差异的显著性。
[0039]三、结果及结论
[0040] 1、化合物(I)对Mo 114细胞的增殖抑制作用
[0041 ] 化合物（I)在不同时间点对Mo 114细胞均有明显的增殖抑制作用。DMS0(0.5 % )组 在4811、7211的增殖抑制率分别是5.2%±0.8%、6.40%±0.9%。不同浓度化合物（1)处理组 的增殖抑制率与DMS0组相比均有统计学意义(P〈0.01)。相同浓度条件下，72h的增殖抑制率 较48h高。化合物（I)对Mo 114细胞48h、72h的IC5〇分别是 19.4±0.2yg/mL、15.7±0. lyg/mL。 不同浓度的化合物（I)均显示一定的增殖抑制效果，且具有时间、剂量赖关系。结果见表1 (注:*标记与Control组比较，P〈0 · 01)。
[0042] 2、化合物（I)对Mo 114细胞周期的影响
[0043] 化合物（I)作用Mo 114细胞48h后，空白对照组G1期细胞比例为37.5% ±0.2%，S期 细胞比例为50.6%±0.1%，62期细胞比例为11.7%±0.1%，01^0组61期细胞比例为 39.6% ±0.1%，S期细胞比例为51.6% ±0.2%，G2期细胞比例为8.7% ±0.2%。化合物（I) 药物20yg/mL、25yg/mL处理组G1期所占细胞比例分别为4.1 % ± 0.1 %、65.8 % ± 0.1 %，S期 细胞所占的比例增加分别为85.1 % ±0.3 %、87.1 % ± 0.25(P〈0.01)，G2期细胞所占比例分 别为10.7%±0.2%、7.0%±0.1%，结果显示61期有明显差别(卩〈0.05)说明化合物（1)阻 滞Molt4细胞处于周期S期。结果见表2(注:*标记与Control组比较，P〈0.01)。
[0044] 3、化合物（I)作用Molt4细胞后的早期凋亡率
[0045] 化合物（I)作用Molt4细胞48h后，Almexin V/PI双染流式细胞仪检测早期凋亡率。 空白对照组细胞早期凋亡率6.6% ±0.4%，DMS0对照组的早期凋亡率7.0%士0.3%，与空 白对照相比无统计学意义(P>〇.〇5)。化合物（I)l〇 yg/mL组、15yg/mL组早期凋亡率分别是 9.5% ±0.3%、15.0% ±0.5%，与空白对照相比有统计学意义(P〈0.05)。结果见表3(注:* 标记与Control组比较，Ρ〈0· 05)。
[0046]结论，在研究中我们发现化合物（I)作用Molt4细胞后能够诱导其显著的周期阻滞 和凋亡，并使细胞周期停留于S期，从而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。化合物（I)在治疗急 性T淋巴细胞白血病方面具有潜在的应用价值。
[0047]表1化合物(I)对Molt4细胞的增殖抑制作用（％，$±s，n = 3)
[0049] 表2各组细胞周期百分比（％，its，n = 3)
[0050]
[0051 ] 表3化合物（I)对Molt4细胞凋亡的影响（％，i±s，n = 3)
[0053] 实施例3
[0054] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0055] 实施例4
[0056] 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口 服液。
[0057] 实施例5
[0058] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0059] 实施例6
[0060] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0061 ] 实施例7
[0062] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0063] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，0'2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将附子 粉碎，用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和 水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步骤 (a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱 10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤(b)中75%乙 醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烧-甲 醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20: 1、12:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷 键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积 洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗急性T淋己细胞白血病的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗急性T淋己细胞白血病的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗急性T淋巴细胞白血病的新的二萜化合物，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜类化合物，可以从附子中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物作用Molt4细胞后能够诱导其显著的周期阻滞和凋亡，并使细胞周期停留于S期，从而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。化合物(Ⅰ)在治疗急性T淋巴细胞白血病方面具有潜在的应用价值，可以用来开发成治疗急性T淋巴细胞白血病的药物。
【IPC分类】C07D493/10, A61P35/02, A61K31/365
【公开号】CN105503895
【申请号】CN201510975955
【发明人】唐晓琦
【申请人】唐晓琦
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月22日