一种白藜芦醇苷酯类衍生物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物催化与生物合成领域，涉及一种白藜芦醇苷酯类衍生物及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 白藜芦醇苷，又名虎杖苷，是一种天然黄酮类活性成分，属羟基二苯乙烯类化合 物，在中药虎杖中含量较高，是中药虎杖的主要药效成分之一，具有显著的抗炎、抗病毒、抗 氧化、抗肿瘤、抗辐射和免疫调节等诸多生理活性。从自然界中寻找活性先导化合物，再进 行结构修饰，是创新药物发现的重要思路，具有风险相对较小、投资少、见效快的特点，适合 我国药物研发的实际。如将多羟基糖苷类或核苷类药物侧链上的羟基或羧基酯化，可获得 羧酸酯类前药，该类前药在细胞膜穿透性、水溶性、对酶的稳定性、生物利用度及半衰期等 方面均较母体药物有很大提高。因此，对白藜芦醇苷中的功能基团进行结构修饰以期获得 具有更高药理活性的新型药物化合物的研究工作一直以来都备受关注。
[0003] 传统黄酮类化合物的酯类衍生物的合成主要采用化学法，包括基团保护法和直接 酰化法，其主要弊端是区域选择性差，产生大量的副产物，产物分离困难，产率较低，反应条 件苛刻，耗能大，产生的"三废"多，容易造成环境污染，且大量有机溶剂的使用也为酯类衍 生物的安全性带来隐患。因此，开发低成本、高效、高选择性的合成工艺方法以取代传统的 化学方法具有重要的实践意义。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于针对上述不足，提供一种白藜芦醇苷酯类衍生物。同时，还提供了 一种生物酶法制备白藜芦醇苷活性酯衍生物的方法，得到的白藜芦醇苷酯类衍生物可应用 于抑菌及清除自由基。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取如下技术方案： 一种白藜芦醇苷酯类衍生物，其结构如通式(I)所示：
其中：R代表2-18个碳原子的直链或支链的饱和烷酰基或不饱和烷酰基。
[0006] 所述的白藜芦醇苷酯类衍生物具体为6' 白藜芦醇苷巴豆酸酯、6' 白藜芦 醇苷山梨酸酯、6'白藜芦醇苷十一碳烯酸乙烯酯，结构式依次如式（Π )、式（ΙΠ )和式 (IV)所示：
上述白藜芦醇苷酯类衍生物的制备方法:将摩尔比为1:1~50的白藜芦醇苷和酰基供 体加入到有机溶剂中，白藜芦醇苷在有机溶剂中的浓度为0.1~60mg/mL，然后按脂肪酶与 白藜芦醇苷质量比1~20:1加入脂肪酶，混合均匀，在20~80°C、100~300rpm下振荡反应 0.5~72 h，分离纯化，得白藜芦醇苷酯类衍生物。
[0007] 所述的酰基供体为巴豆酸乙烯酯、山梨酸乙烯酯或十一碳烯酸乙烯酯。
[0008] 所述的脂肪酶为脂肪酶Candida antar c t i ca B、脂肪酶Thermomyces Ianuginosus、月旨肪酉每Rhizomucor miehei或月旨肪酉每Burkholderia cepacia。
[0009] 所述的脂肪酶Candida antarctica B，固定化于大孔阴离子树脂，比酶活为 44.04U/g;所述的脂肪酶Thermomyces Ianuginosus，固定化于大孔阴离子树脂，比酶活为 55.02U/g;所述的脂肪酶Rhizomucor miehei，固定化于大孔阴离子树脂，比酶活为12.57U/ g;所述的脂肪酶BurkhoIderia cepacia，固定化于娃藻土，比酶活为12.36U/g。
[0010] 所述的有机溶剂为叔戊醇、环己酮、2-甲基四氢呋喃、丙酮、叔丁醇、1，4_二氧六 环、四氢呋喃和乙腈中的一种或几种。
[0011] 所述的分离纯化方法为:将反应混合物过滤除酶，滤液用体积比1:4的石油醚/乙 酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液旋转蒸发，真空干燥至白色粉末状。
[0012] 本发明白藜芦醇苷酯类衍生物的应用，其具有抑菌性，对金黄色葡萄球菌的抑菌 效果显著，同时可用于清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子。
[0013] 本发明针对白藜芦醇的具体理化性质，通过大量的实验筛选确定了能够生物催化 合成白藜芦醇苷酯化衍生物的反应体系。一般认为，酶在疏水性溶剂中的催化活性比在亲 水性溶剂中高，酶促反应也就更易进行。对于本发明而言，白藜芦醇苷属于强极性化合物， 在疏水性溶剂中的溶解度非常低，这成为酶法修饰白藜芦醇苷生成酯类衍生物的一个巨大 的障碍。故前人的研究中，大多选用强极性溶剂，如吡啶、DMSO和DMF等作为反应介质，但强 极性的有机溶剂易于夺取酶分子表面的必需水而使酶失活。另一方面，研究表明可以通过 改变反应介质来调控反应的选择性，如区域选择性、对映体选择性和底物选择性等。同时， 在非水介质中，底物、产物分配的改变，溶剂本身具有的分子毒性和相毒性都可能影响酶的 催化活性。为此，本发明在前期大量实验的基础上，选取了九种疏水性不同的有机溶剂(叔 戊醇、叔丁醇、环己酮、2-甲基四氢呋喃、DMF、1，4-二氧六环、四氢呋喃、乙腈、丙酮），固定化 酶在这些溶剂中催化白藜芦醇苷酰化反应的状况差异较大。尽管底物在强极性溶剂，如DMF 中具有高的溶解度，但酶在这些介质中没有表现出活性。白藜芦醇苷在其他溶剂中均有一 定的溶解度，且酶在其中均存在一定的反应活性，白藜芦醇苷酯化衍生物的转化率也各不 相同。而其中采用2-甲基四氢呋喃，酶促反应在其中反应速度最快，转化率最高达到99%以 上，对酶反应的区域选择性无影响，对合成的几种白藜芦醇苷酯类衍生物具有普遍适用性。
[0014] 本发明与现有技术相比具有如下的优点： 1)以脂肪酸烯酯为酰基供体，采用脂肪酶催化白藜芦醇苷进行酰化反应，合成白藜芦 醇苷酯类衍生物，具有区域选择性高，产率高，产物纯度高，工艺简单可控的优点。
[0015] 2)本发明反应条件温和，环境友好，克服了传统化学方法选择性低、易生成副产 物、需要保护和脱保护操作及产率低等缺点。
[0016] 3)经过酯化后，白藜芦醇苷酯化衍生物其抗氧化性得到改善，其对金黄色葡萄球 菌的抑制活性得到很大提高，其对清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子的清除效果明 显。
【附图说明】
[00Π ]图1为实施例10中不同待测液对DPPH自由基清除能力效果对比图； 图2为实施例10中不同待测液对羟自由基清除能力效果对比图； 图3为实施例10中不同待测液对超氧阴离子清除能力效果对比图； 图中：P为白藜芦醇苷;P4为6 '' -0-白藜芦醇苷巴豆酸酯;P6为6 '' -0-白藜芦醇苷山梨 酸酯;Pl 1为6 '' -0-白藜芦醇苷十一碳烯酸酯。
【具体实施方式】
[0018] 为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但是本发 明要求保护的范围并不局限于实施例的范围。
[0019] 下述实施例中所采用的脂肪酶： 脂肪酶Candida antarctica B，固定化于大孔阴离子树脂，比酶活为44.04U/g; 脂肪酶Thermomyces Ianuginosus，固定化于大孔阴离子树脂，比酶活为55.02U/g; 脂肪酶Rhizomucor miehei，固定化于大孔阴离子树脂，比酶活为12.57U/g，购买于 Novozymes 公司； 脂肪酶Burkholderia cepacia，固定化于娃藻土，比酶活为12.36U/g，购买于日本 Amano公司。
[0020] 实施例1: 向带塞反应瓶中加入3 mL叔戊醇，然后加入12 mg白藜芦醇苷和21 mg山梨酸乙烯酯， 再加入100 mg脂肪酶Thermomyces lanuginosus，混合均勾后，置于40°C，200 rpm的水浴 恒温振荡器内振荡，利用高效液相色谱监测反应，反应10 h后，过滤除去脂肪酶，滤液用体 积比1:4的石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液旋转蒸发，真空干燥至白色粉末状，即得 6 白藜芦醇苷山梨酸酯，产率为68.4%，区域选择性大于99%。
[0021] 1H NMR (DMSO-de) δ： 9.63 (br s, 1H, OH phenolic), 9.51 (br s, 1H, OH phenolic), 7.43 (d，2H，H2,+H6, )，7.18-7.13 (m，1H，H4…），7.05 (d，1H，Hvinyi)， 6.91 (d，1H，H3…），6.88 (t，1H，H2…），6.87 (t，1H，Hvinyi), 6.81 (d，1H，H3'）， 6.70 (br s, 1H, H51), 6.63 (br s, 1H, H2), 6.36 (t, 1H, He), 6.16-6.12 (m, 1H, Hs111), 5.80 (dd, 1H, H4), 5.42 (br s, 1H, OH211), 5.36 (br s, 1H, OH311), 5.24 (br s, 1H, OH4-1), 4.94 (d, 1H, Hi··), 4.47 (d, 1H, He11), 4.11 (dd, 1H, He11), 3.74- 3.71 (m, 1H, H511), 3.39-3.36 (m, 1H, H211), 3.32-3.30 (m, 1H, H311), 3.25- 3.22 (m，1H，He), 1.71 (d，3H，H6 …）· 13C 匪 R (DMSO-Cl6) δ: 166.77 (Cl…）， 159.05 (C3), 158.86 (C5), 157.85 (C4'），145.64 (C3…），140.43(C4…），139.82 (Cl), 129.86 (C2,+C6,)，128.95 (C5…+Cr), 128.40 (CvinyI)，125.76 (CvinyI)，118.75 (C2···), 116.05 (C3-+C5·), 107.62 (Ce), 104.79 (C2), 103.37 (Ci··), 100.55 (C4), 76.89 (C2··), 74.29 (Cs11), 73.62 (C311), 70.59 (C411), 64.17