一种黑种草皂苷a的制备方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种黑种草皂苷A的制备方法，本发明同时涉及该化合物物在抗肿瘤 和抗炎功效方面的应用，属保健食品与生物医药领域。 技术背景
[0002] 毛茛科黑种草属(Nigella)植物分布在地中海、西亚、中亚、中国新疆等地，黑种草 子系维吾尔族(维语斯亚旦）和地中海地区习用药材，具有止咳平喘、抗血小板聚集、抗氧 化、抗肿瘤、保肝、降脂、降糖等多种药理活性，常用于胸闷气足，乳肿，乳汁减少，耳呜，热 淋，石淋，闭经等症。黑种草子中含油30-35%，是维族常用的功能食品;此外，黑种草子中还 富含黄酮、皂苷、生物碱等生物活性物质。近年来，黑种草子中含有的皂苷类成分具有一定 的体外抗肿瘤活性，因而对其研究工作受到关注。
[0003] 黑种草子现有文献研究侧重于对该类皂苷类成分的分离和鉴定，一般采用醇提、 大孔树脂精制、硅胶和反相硅胶多次柱层析纯化等复杂工艺，其分离制备工艺步骤复杂、得 率低，主要局限于实验室制备规模。赵军等（中国专利号CN201010250936.1)公开了一种"黑 种草子总苷提取物及其制备方法和应用"，所述工艺主要通过大孔树脂精制获得黑种草子 总苷提取物，其中含有50 %至80 %的皂苷、3 %至11 %的黄酮。刘玉明等（中国专利申请号 CN201310619087.6)公开了"一种从斯亚旦中提取异株五加甲苷的方法"，所述工艺主要通 过乙醇提取、乙酸乙酯萃取除杂、萃取后水相经大孔树脂精制获得异株五加甲苷（即黑种草 皂苷A)提取物(纯度范围57.5%至70.3%)。
[0004] 为进一步综合开发利用黑种草属植物资源，发明人对黑种草子中的化学成分进行 深入研究，从中分离鉴定了生物碱、阜苷等成分[Lian-li Sun，Study on antitubercular constituents from the seeds of Nigella Glandulifera.Chem Pharm Bull,2013,61 (8) :873-876]。黑种草皂苷A是其中的主要成分，又名异株五加甲苷，其化学名：常春藤皂苷 元-3-〇-[f3_D-吡喃木糖基（l-3)-a-L-鼠李糖基（l-2)-a-L-阿拉伯糖基]-28-0_[a-L-鼠 李糖基（1-4)-β-D-匍糖基-(1-6)-β-D-匍糖苷]。米用优选的大孔树脂精制工艺，制备获 得的黑种草总皂苷中，皂苷A含量约为50% [栾明，维药黑种草子中活性成分HE-III的大孔 树脂纯化工艺研究，中国药学杂志，2014,49(12) :1014-1017]。
[0005] 通过深入研究，本发明首次研制出高纯度黑种草皂苷A(含量大于90%)的规模化 制备工艺，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种易于实现产业化的高纯度黑种草苷A制备工艺。
[0007] 本发明提供的黑种草皂苷A的制备方法包括以下步骤：
[0008] (1)选取黑种草属植物种子原料，采用水或醇-水混合溶剂进行提取，提取液浓缩， 过滤，上大孔树脂进行吸附，依次用水、50-80 %乙醇梯度洗脱，收集50-80 %乙醇洗脱液，浓 缩，获得黑种草总皂苷浓缩液；
[0009] (2)由（1)所得黑种草总皂苷浓缩液，采用加压制备色谱系统，以20-120μπι粒径范 围的碳十八改性硅胶为填料，40-60%甲醇为流动相进行分离，收集含有黑种草皂苷A的流 份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90 %的黑种草皂苷A成品。
[0010] 所述工艺步骤（1)中，所述黑种草属植物可选自腺毛黑种草（Nigella glandul if era)、黑种草(Nigel la damascena)、果黑种草(Nigella sativa)等同属植物中 的任意一种。黑种草皂苷A在黄花败酱、异株五加、野木瓜等其它科属植物中也有发现，但其 含量在黑种草子中最高。提取溶剂为水、含水乙醇中的任意一种，其中优选60-80 %乙醇。所 述大孔树脂为苯乙烯系树脂，其中优选弱极性大孔树脂。大孔树脂洗脱优选60-80%乙醇洗 脱液。根据需要，大孔树脂乙醇洗脱液经浓缩后，可进一步采用超滤透析和纳滤浓缩工序处 理，获得黑种草总皂苷浓缩液。
[0011]所述工艺步骤(2)中，所述加压制备色谱系统为低压或中压制备色谱，优选中压制 备色谱系统。所述碳十八改性硅胶填料平均粒径范围20-120μπι，优选40-80μπι。所述流动相 优选45-55%甲醇范围；洗脱方式可为等度或梯度洗脱，优选等度洗脱。所述含有黑种草皂 苷A的流份采用在线紫外检测，检测波长为200-210nm。
[0012] 本发明通过系统工艺研究，所完成的黑种草皂苷A制备技术路线有以下特色：（1) 采用优选的大孔树脂梯度洗脱工艺，结合超滤透析、纳滤浓缩工序，可有效除去黑种草总皂 苷浓缩液中的低分子量黄酮、寡糖等杂质，同时对浓缩液进行过滤澄清，简化了后续纯化工 艺负担；（2)创新性应用中压反相柱色谱工序，可通过一步制备柱层析获得高纯度黑种草皂 苷A产品，成功实现了纯化工序的自动化和生产可行性。本发明产品纯度高，工艺简洁、可操 作性强，易于实现产业化放大。
[0013] 本发明同时对所述黑种草皂苷A的抗肿瘤和抗炎作用进行了考察。研究结果表明， 黑种草阜苷A(80、120mg/kg，i .p .)可显著抑制SW620人结肠癌裸鼠的瘤重；黑种草阜苷A (100、200mg/kg)对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症有显著抑制作用。结果表明所述黑种草皂 苷A具有明确的抗结肠癌、抗炎等作用，因而可以应用于具有抗肿瘤和抗炎功能的相关药物 或保健食品中。
[0014] 本
【发明内容】
是通过大量实验研究、工艺优化分析完成的，以下述具体实施例进行 说明。
【附图说明】
[0015] 图1为采用本发明实施例1中提取的步骤(1)黑种草总皂苷样品HPLC色谱图。
[0016] 图2为采用本发明实施例1中提取的步骤(2)黑种草皂苷A样品HPLC色谱图。
[0017]图1和图2中，色谱峰1为黑种草阜苷A。
【具体实施方式】
[0018] 本发明所述的黑种草皂苷A是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法 是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的 对本领域发明权利要求的限制。
[0019] 实施例1黑种草阜苷A的制备
[0020] 黑种草子药材购自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐(批号:NG20121025)，经鉴定为毛 莨科植物腺毛黑种草(Nigella glandulifera Freyn et Sint)的干燥成熟种子。
[0021] 采用HPLC测定黑种草皂苷A含量，色谱条件：Agilent TC-C18色谱柱（250mmX 4.6mm，5μηι) ;ELSD检测；流动相为乙腈-水(32:68)等度洗脱20min;流速1.0 mL/min;柱温40 °C;进样量20yL。大孔树脂制备工艺参考栾明报道进行[中国药学杂志，SOH^ashlOH-iOn]。
[0022] (1)取榨油后的黑种草子药材10kg，加10倍量70%乙醇回流提取3次，每次lh;合并 滤液，减压回收至无醇味，用水稀释至40L，过滤，上AB-8大孔树脂层析柱(柱体积30L/BV)， 先用水洗脱6BV，再用70 %乙醇洗脱4BV，收集70 %乙醇洗脱液，减压浓缩至12L，其中4L备 用;余下8L浓缩液经60°C真空干燥，得黑种草总皂苷143g，HPLC测定其中黑总草皂苷A含量 为53.5%，即^：色谱图参见附图1。
[0023] (2)取黑种草总皂苷浓缩