基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国蜜蜂饲养历史悠久，蜜蜂种质资源丰富，但是长久以来，我国境内仅发现存在 东方蜜蜂，并无原生的西方蜜蜂。东方蜜蜂采集能力稍次于西方蜜蜂，伴随着西方蜜蜂的引 进，我国养蜂者越累越多的开始饲养西方蜜蜂，我国原生蜂种质资源受到威胁。引进的资源 对我国本地群体造成了威胁；同时引进资源也存在一定程度的不适应本地环境的问题。如 果能够在我国境内找到原生的西方蜜蜂对我国蜜蜂种质资源有着重要意义。中国蜜蜂种质 资源委员会主任石巍老师与新疆自治区蜂业管理站工作人员一直从事加强对新疆原有伊 犁黑蜂保护的工作，经过多年的努力，首次在中国新疆伊犁境内发现欧洲黑蜂自然种群，并 且与目前国际上已知的西方蜜蜂亚种至少存在9万年的分化，证明中国也是西方蜜蜂的原 产地，结束了我国没有西方蜜蜂自然种群分布的历史，这在畜禽资源研究方面具有很大的 突破性意义。中国的西域黑蜂个体较大、越冬性能好、抗逆性强、抗病能力十分突出，而且蜂 王产卵力强，能维持强群和蜂群极大的采集能力，既可作为推广普及的新品种，也可以作为 育种素材，作进一步的深入育种研究，具有很好的发展前景。
[0003] 中国发现原生的西方蜜蜂，在国内外产生了较大的影响，但西域适应黑蜂本地环 境的重要基因尚没有记录。为了更加深入的保护西域黑蜂，有效的利用西域黑蜂为我国蜜 蜂育种工作服务，提供西域黑蜂特有的基因具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供了西域黑蜂的基因及其应用。本发明采用全基因组测序对 西域黑蜂大量个体进行全基因组重测序，获得了西域黑蜂特有的基因。
[0005 ]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了基因，具有：
[0007] (I)如SEQ ID No. l(Foxo基因）或SEQ ID No.2(Ebony基因）所示的核苷酸序列；或 [0008] (Π )如SEQ ID No. 1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补序列；或
[0009] (ΙΠ )与（I)或（Π )的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（I) 或（Π )的核苷酸序列不同的序列;或
[0010] (IV)具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个 或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO: 1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列 功能相同或相似的核苷酸序列。
[0011]
[0012]在本发明的一些具体实施方案中，所述多个核苷酸序列为2个、3个、4个、5个、6个、 7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个。作为优选，如SEQ ID No. l(Foxo基因）中所述多个核 苷酸序列为2个、3个、4个、5个、6个或7个;SEQ ID No.2(Ebony基因）所示的核苷酸序列中所 述多个核苷酸序列为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个。
[0013] 本发明还提供了一种含有所述基因（Foxo基因或Ebony基因）的重组DNA。
[0014] 本发明还提供了一种表达载体，插入所述重组DNA，并以微生物、动物细胞或植物 细胞作为宿主细胞。
[0015 ]本发明还提供了一种由所述表达载体转化的转化子。
[0016]本发明还提供了所述基因（Foxo基因或Ebony基因）在物种鉴定中的应用；所述物 种包括西域黑蜂。
[0017]此外，本发明还提供了所述基因（Foxo基因或Ebony基因）在物种资源遗传多样性 中的应用。
[0018] 本发明还提供了所述基因(Foxo基因或Ebony基因）在抗寒中的应用。
[0019] 本发明还提供了一种鉴定西域黑蜂的引物组，包括能够扩增所述基因（Foxo基因 或Ebony基因）的引物。
[0020] 本发明还提供了一种鉴定西域黑蜂的试剂盒，包括所述引物组。
[0021] 本发明还提供了一种鉴定西域黑蜂的方法，包括如下步骤：
[0022]步骤1:获得待测品种的DNA;
[0023] 步骤2:通过基因比对，如果含有所述基因（Foxo基因或Ebony基因），则所述待测品 种为西域黑蜂;反之，如果不含有所述基因（Foxo基因或Ebony基因），则所述待测品种不为 西域黑蜂。
[0024] 本发明提供了西域黑蜂特有的基因序列。全基因组测序，即对一种生物的基因组 中的全部基因进彳丁测序，测定其DNA的喊基序列。全基因组测序覆盖面广，能检测个体基因 组中的全部遗传信息，准确性高。每个个体从受精卵开始就继承了父母的DNA遗传信息，并 且携带一生，不易改变。全基因组测序就是通过运用新一代高通量DNA测序仪，进行10-20倍 覆盖率的个体全基因组测序，然后与该物种基因组精确图谱比较，得到完整的个体全基因 组序列，破译个体全部的遗传信息的过程。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找 到特定物种（品种)特有的大量的单核苷酸多态性(SNP)位点。本发明首次鉴定出了西域黑 蜂适应寒冷气候的关键基因。包括2个基因：F 〇X〇、Eb〇ny。这些基因在西域黑蜂与其它地区 蜜蜂的分化及西域黑蜂对本地环境的适应性进化具有重要作用。
[0025] 本发明提供的Foxo基因或Ebony基因能够用于鉴定西域黑蜂与其他物种；也能够 用于研究蜂的物种资源遗传多样性;还能够用于研究抗寒基因。这将填补我国科研人员在 西域黑蜂领域的研究空白。
【附图说明】
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0027] 图1示2个基因在西域黑蜂和其它代表性群体(欧洲黑蜂、非洲蜜蜂）中的基因树； [0028]图2示基因组DNA提取结果图；所有样品均获得高质量的大片段DNA，所有样品中未 出现明显降解；图中"标"为标准品上样5ul(10ng/ul);M_l为Trans 2k plus DNA分子量标 准，上样2ul;M-2为Trans 15k plus DNA分子量标准，上样2ul;其余为样品DNA;
[0029]图3以)示利用？^3&」4111&'8〇和011几个统计量对两个基因进行扫描，均检测出明 显的受选择信号，表示该基因在西域黑蜂中受到了特定的自然选择；图3(B)显示了两个基 因具有特殊的DNA序列;基因区的SNP位点；与其它亚种相比有明显基因型差异。
【具体实施方式】
[0030]本发明公开了西域黑蜂的基因及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适 当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说 是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进 行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用 进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0031 ]本发明提供的基因的获得与检测方法如下：
[0032] 1.样品采集。采集活体蜜蜂样品，并尽快放入90%酒精中保存。在本发明的另一些 具体实施方案中，样品保存，除了90%酒精保存，也可以用纯度更高的酒精，或者液氮、干冰 等低温保存方式。
[0033] 2.提取样品高质量DNA(脱氧核糖核酸）。
[0034] 3.将DNA样品进行I Ilumina高通量测序，获得DNA序列原始数据。DNA高通量测序可 采用任何高通量测序平台，除上述IIlumina平台外，还可以选用SOLiD平台，454测序等二 代、三代测序平台。
[0035] 4.过滤掉低质量序列。过滤规则包括：1)末端"N"的个数应小于等于序列长度的 10% ;2)测序质量低于5的碱基数应不超过序列长度的50%。
[0036] 5.以西方蜜蜂（Apismellifera)在NCBI公共数据库上的基因组为参考基因组 (apiMel4.5)，利用BWA软件进行序列比对，比对参数为"_t_k 32-M-R"。参考基因组最新版 本为apiMel4.5,更新版的参考基因组发布后，可采用新版参考基因组。
[0037] 6.利用SAMtools'mpileup程序获得群体的SNP基因型，将获得的基因型进行过滤， 获得最后的结果。过滤的规则有：1)质量值应不小于20; 2)在序列间隔处5个碱基以内的SNP 应过滤掉;3)测序深度应当大于等于4,小于等于1000;获得SNP基因型的程序可以