卡巴他赛免疫原、特异性抗体和检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及卡巴他赛免疫原、特异性抗体和检测试剂及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] 卡巴他赛(Cabazitaxel)结构式如式（ΙΠ )所示：
[0004] 卡巴他赛，别名：70，1〇少二甲氧基多西紫杉醇，化学名：（2€[，50，70，100，13€0-4-乙酰氧基 _ 13-[[(2R，3S)-3_[(叔丁氧幾基)氨基]_2_羟基_3_苯丙酰基]氧基]-1 -羟基-7， 10-二甲氧基-9-氧代紫杉-5,20-环氧基-11-烯-2-苯甲酸酯，是一种化学半合成紫杉烷类 小分子抗肿瘤药物，通过从红豆杉中萃取的前体化合物半合成而来。卡巴他赛是多西紫杉 醇的二甲氧基衍生物，通过对后者两个羟基的甲氧基化，消除了其对多药耐药基因 MDRl编 码的P-糖蛋白（P-gp)的亲和力，而该蛋白介导的多药耐药被认为是肿瘤细胞抵抗传统紫杉 烷类化疗药物的经典机制。作为一种微管抑制剂，卡巴他赛通过与微管蛋白结合，在促进微 管二聚体装配成微管的同时阻止微管的去多聚化过程，从而抑制微管分解，增加微管的稳 定性，进而抑制肿瘤细胞的有丝分裂，将肿瘤细胞阻滞于G2/M期，并促进其凋亡，最终抑制 肿瘤组织的增殖。临床上本品通常与泼尼松联用，用于晚期转移性前列腺癌患者的化疗。卡 巴他赛的血药浓度与治疗效果之间有着密切关系，低于有效血药浓度达不到治疗效果，高 于有效血药浓度会导致严重的毒副作用。因此，快速、准确、高通量、低成本的测定卡巴他赛 在肿瘤患者体内的血药浓度，对于降低毒副作用和提高患者生存率都具有重要意义。
[0005]目前，国内外监测卡巴他赛血药浓度的主要方法是酶联免疫吸附法(ELISA)、高效 液相色谱法(HPLC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等 传统方法，但这些方法都不能满足高通量与低成本的临床需求。目前市场上缺乏稳定性好、 灵敏度高、特异性强的卡巴他赛检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂，因此，研发生 产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的卡巴他赛测定试 剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
【发明内容】
[0006] 本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用卡巴他赛衍生物制备免疫原性强的卡 巴他赛免疫原及其抗体，并提供了一种操作简便、灵敏度高、特异性强的检测试剂。应用均 相酶免疫检测技术实现在全自动生化分析仪上对卡巴他赛的测定，可以高通量、快速化、精 确地确定样品中的卡巴他赛含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点， 有效降低卡巴他赛检测成本，有利于临床的个体化治疗，适合临床广泛推广使用。
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种卡巴他赛衍生物的合成方法。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种免疫原性强的卡巴他赛免疫原。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种卡巴他赛免疫原的制备方法。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供使用本发明卡巴他赛免疫原制备得到的特异性强 的抗卡巴他赛特异性抗体。
[0011] 本发明的又一个目的在于提供一种卡巴他赛检测试剂。
[0012] 本发明的再一个目的是提供卡巴他赛检测试剂的制备方法。
[0013] 免疫原性与所合成的卡巴他赛衍生物分子结构及所选载体种类有关，现有技术中 卡巴他赛免疫原的免疫原性较弱，所得到抗体的特异性、与卡巴他赛的结合力，敏感度都不 如本发明。本发明的卡巴他赛免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗卡巴他赛特异 性抗体。该抗体特异性高，与卡巴他赛的结合力强。由该抗体制备得到的卡巴他赛检测试 剂，可以快速、准确地确定样品中的卡巴他赛含量。
[0014] 本发明所采取的技术方案如下：
[0015] -种卡巴他赛免疫原，其结构式如式⑴所示：
[0017] 式中，R为连接基团-CO-(CH2)n-⑶0-，n是1至20之间的整数。优选R为-CO-(CH 2)2-COO-〇
[0018]载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋 白。更优选为牛血清白蛋白。
[0019] 卡巴他赛免疫原的合成途径和方法如下：
[0020] 1.卡巴他赛衍生物的制备方法：
[0021 ] -种卡巴他赛衍生物，其结构式如式（Π )所示：
[0023] 式中，R为连接基团-CO-(CH2)n-COO-, η是1至20之间的整数。
[0024]上述卡巴他赛衍生物的合成路线及制备步骤如下：
[0026] (I)称取0.5~2 . Og卡巴他赛、1.0~4. Og化合物A加入反应体系中，然后用10~ 40ml吡啶或者干燥的苯在连续回流的玻璃烧瓶中进行孵育。
[0027] (2)将此反应混合物在70 - 80°C的回流温度下持续加热3~12小时，然后将反应混 合物缓慢冷却至室温(可在室温条件下让其自行冷却），轻轻倒去混合物上层的多余的吡啶 或苯。
[0028] (3)将剩余的有机成分在负压条件下持续通入氮气流使其蒸发干燥，得到的干燥 残留产物即为卡巴他赛衍生物。剩余的有机成分指的是反应混合物去除吡啶或苯之后的成 分。
[0029] (4)将上述得到的产物用蒸馏水配制的60%乙醇冲洗5~20次以上，以获得卡巴他 赛半琥珀酸脂(卡巴他赛衍生物)的重结晶。60 %指的是体积份数，即乙醇体积为60份，蒸馏 水体积为40份。
[0030] (5)通过薄层色谱法(TLC)这一标准分析方法对最终产物的产率进行定量分析，最 终合成得到的卡巴他赛半琥珀酸酯残留物通过TLC实验显示其相对迀移系数(Rf)大约为 0.1-0.15，然而作为对照的卡巴他赛显示出更大的Rf值，大约为0.3-0.4。在标准合成反应 中，终产物卡巴他赛衍生物的平均产率大约为97%。以上步骤（1)-(5)方法简便，得到的卡 巴他赛衍生物纯度高。
[0031]本发明中，卡巴他赛衍生物的制备过程的步骤(1)中的化合物A选用了丁二酸酐为 合成原料，故所得的最终产物卡巴他赛衍生物的链接基团R为-CO - (CH2) 2 - COO -。当η取其他 值时，选用其他含有3-22个碳原子的烷二酸或相应的酸酐进行实验时，合成方法完全一致。 其中选用丁二酸酐时，η取值为2，碳原子个数为4个。
[0032] 2.卡巴他赛免疫原的合成：
[0033] (1)将载体蛋白100~30011^溶解于25~7511110.214!18.5的磷酸缓冲液中 ；
[0034] (2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100~300mg本发明合成的卡巴他赛 衍生物、1.5~6ml二甲基甲酰胺、1.5~6ml乙醇、3.5~10.Oml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲 液、100~300mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、25~75mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺， 将这些化学品在室温下搅拌溶解反应20~60min;
[0035] (3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2~8°C下搅拌过夜，得到抗原； 将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到卡巴他赛免疫原。
[0036]本发明中当η取1~20范围内的其他整数时，用上述方法可以制备出如式（I)所示 的卡巴他赛免疫原。载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白和甲状腺 球蛋白。优选的，载体为血清蛋白。更优选的，载体为牛血清白蛋白。
[0037]本发明中提供的连接基团R为-CO-(CH2)n-C00-，免疫原性强弱与所合成的卡巴他 赛衍生物分子结构，连接基团的结构及所选载体种类有关，本发明连接基团的选取也具有 增加免疫原性的作用，但是η取1至20之间的任意整数时，使用不同η值的卡巴他赛衍生物制 备的卡巴他赛免疫原均具备强免疫原性，都能制备高效价的特异性抗体。
[0038]本发明的抗卡巴他赛特异性抗体，由上述的卡巴他赛免疫原免疫实验动物后产生 得到，制备的具体步骤如下：
[0039] (1)用PBS将上述合成的卡巴他赛免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用 0.5~2. Oml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射。
[0040] (2)2~3周后，再用0.5~2.Oml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动 物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3~6次。
[0041 ] (3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000~1:50000的抗卡巴他赛 特异性抗体。
[0042]本发明的抗卡巴他赛特异性抗体为完整的抗体分子，也包括保留与卡巴他赛特异 性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。本发明的抗体是多克隆抗体也可以是单克隆抗体， 优选为多克隆抗体。
[0043]本发明的抗体为采用单一的卡巴他赛免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗 体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体;所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵 羊、豚鼠或马的一种，优选为兔。
[0044] 本发明提供一种卡巴他赛检测试剂，含有上述抗卡巴他赛特异性抗体和指示试 剂。
[0045] 本发明指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指 示试剂为酶试剂，由卡巴他赛酶标偶联物和酶底物所组成。
[0046]上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;上述酶底物为葡萄 糖-6 -磷酸。所述半抗原为卡巴他赛衍生物。
[0047]卡巴他赛均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和 酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是不混合的且分开放置，所以将酶的底物与上 述抗卡巴他赛特异性抗体混合在一起。因此，卡巴他赛均相酶免疫检测试剂包括两类试剂： [0048] (1)试剂A由抗卡巴他赛特异性抗体和均相酶底物混合而成，具体制备步骤如下：
[0049] 1)将2.0~6. Og氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、1.0~3 . Og葡萄糖-6-磷 酸(G-6-P)用0.5~2L 55mM、pH=8.0的Tris缓冲液