金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种金属离子为桥接剂的18β_甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱。
【背景技术】
[0002]甘草是一种传统的中草药，性味甘平，有清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛等功效。甘草中主要活性成分是甘草酸，但由于18位手性碳原子的构型不同，产生一对差向异构体18α-甘草酸和18β_甘草酸，二者经酸式水解后，生成18α-甘草次酸和18β_甘草次酸。β-甘草次酸在抗病毒方面要强于甘草酸。此外，孙浩洋等[孙浩洋，李清，陈威，等.甘草次酸差向异构体单独给药和联合给药后在大鼠体内的药动学研究[J].药学学报，2012.]通过甘草次酸差向异构体在大鼠体内药动学研究证实甘草次酸差向异构体的拆分研究就有实际意义。
[0003]高效液相色谱法已经广泛地应用于甘草中甘草酸含量测定和甘草酸差向异构体的分离分析中。但是关于甘草次酸拆分和测定的文献报道却不是很多。Zou等[Zou Q，WeiP,Li J，et al.Simultaneous determinat1n of 18alpha_and 18beta-glycyrrheticacid in human [J].B1med Chromatogr，2009.]用液质技术，使用ODS液相色谱柱，流动相为V(醋酸铵溶液10mmol/L):V(甲醇):V(乙腈)=40:36: 24，测定人血浆中α-GA与β-GA的含量。姚碧霞等[姚碧霞，杨新梅，郑慧敏，邓毓文，翁文.甘草次酸差向异构体的高效液相色谱分离分析[J].化学试剂，2014.]应用Chromolith RP_18e整体柱色谱柱，以V(乙酸铵8mmol/l): V(乙腈):V(甲醇)=52:40:8为流动相，使甘草次酸差向异构体达到基线分离。
[0004]天然产物是药物开发的原料之一，其组分多样，成分复杂，且有效成分含量低难于富集。传统的提取方法如热水浸提法、溶剂回流法等都耗溶剂、耗时、耗能并且提取率较低。近年来，固相萃取(solid phase extract1n,SPE)已成为药物分析的常用富集技术，是一种以色谱分离为基础的样品前处理方法，是指液体样品在一定压力作用下通过装有固体吸附剂的固相萃取装置，分析物和杂质被吸附并保留在固相萃取柱上的实验方法。固相萃取中许多商用的吸附剂，由于选择性不高，对于组分复杂的样品来说常常发生共萃取的现象。对于高选择性的SPE材料来说，可以避免这种现象，但是价格过于昂贵且性质不稳定。然而，用分子印迹聚合物作为SPE吸附剂是一种很有利的替代方法。
[0005]分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymers , MIPs)具有特异性和亲和性，制备过程简单，操作方便，用作固相萃取剂，可克服生物、天然产物或是环境样品体系复杂、预处理手续繁杂等不利因素。基于MIPs对模板分子具有高选择性和特异识别性，对复杂样品中目标分子的采集、富集和分析提供了极大的便利。将分子印迹技术和固相萃取技术相结合即分子印迹固相萃取(MISPE)应用于天然产物的分离、富集和纯化中具有很强的实际意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种金属离子为桥接剂的18β_甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱。以乙酸钴作为金属离子桥接剂，以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，Ν，Ν-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜作为三元致孔剂，合成具有预定选择性的18β-甘草次酸印迹聚合物。该制备方法容易操作，制备过程简单，并通过调整模板单体比例，交联剂含量等获得具有明显印迹效果的聚合物(印迹因子为3.50)，和不加金属离子的印迹聚合物做对比，印迹因子提高了近3倍。将合成好的分子印迹聚合物干燥、研磨、过筛(74μπι)后作为吸附剂装填在聚丙烯固相萃取柱中，通过分子印迹固相萃取技术，对甘草次酸粗提物中的18β-甘草次酸进行分离富集。获得样品的回收率为91.1%，样品的纯度为93.8%。本发明可应用于18β-甘草次酸的分离和富集。
[0007]利用分子印迹固相萃取技术对甘草次酸差向异构体进行分离研究。采用金属离子乙酸钴作为桥接剂，18β_甘草次酸为模板分子合成分子印迹聚合物。金属离子加入印迹体系中，可作为枢纽，分别与模板和功能单体作用，以较强的金属配位键作用力取代模板和功能单体之间较弱氢键等作用力，进而增强印迹空穴的识别能力，提高印迹效果[Bai L H,Chen X X， Huang Y P， et al.Chiral separat1n of racemic mandelic acids byuse of an 1nic liquid-mediated imprinted monolith with a metal 1n as self-assembly pivot[J].Analytical B1analytical Chemistry, 2013，405(27):8935-8943.]。该方法合成的聚合物对18β-甘草次酸的印迹因子(IF)为3.5(L
[0008]本发明提供的金属离子为桥接剂的18β_甘草次酸分子印迹聚合物的原料质量组成为:
18β-甘草次酸1.55 - 4.12 %
乙酸钴0.82 - 2.18 %
4-乙烯基吡啶2.73 - 2.80 %
偶氮二异丁腈0.26 - 0.32 %
二甲基丙烯酸乙二醇酯15.63 - 31.25 %
1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐 43.38 - 43.80 %
N,N-二甲基甲酰胺3.18 - 3.59 %
二甲基亚砜18.47 - 20.01 %
上述的各原料的质量组成之和为100 %。其中18β-甘草次酸为模板分子，乙酸钴为金属桥接剂，18β-甘草次酸与乙酸钴的摩尔比为1:1。
[0009]本发明提供所述的一种以金属离子为桥接剂的18β_甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱的制备方法，具体包括下列步骤:
按计量将模板分子18β_甘草次酸，金属桥接剂乙酸钴，功能单体4-乙烯基吡啶，引发剂偶氮二异丁腈，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，溶于致孔剂为离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、Ν，Ν-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜的混合致孔剂溶液中；超声溶解25-30 min，使之溶解、澄清，除去液体中氧气，将预聚合物注入密封容器中，于50-60 °C水浴中反应16-18h，得到金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物。
[0010]或再将预聚合物注入不锈钢柱(100 X 4.6 mm 1.D.)中，将两端封住，于50-60°C水浴中反应16-18 h;将反应好的柱子连于HPLC的高压栗上，先用乙腈冲洗，除去整体柱中残留的致孔剂及可溶性物质，流速由0.1 mL/min逐渐升至0.5 mL/min，冲够100 mL后换成甲醇/乙酸(v/v，7/3)混合溶液150 mL冲洗除去模板分子，得到金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物整体柱。
[0011]将上述冲洗好除去模板分子的分子印迹聚合物干燥，研磨，过74μπι筛后，装入固相萃取柱中，其两端放置以聚丙烯为材料的防止颗粒渗漏的塞片，可制成用于18β_甘草次酸的分离和富集得固相萃取柱。
[0012]非印迹聚合物的合成除不加模板分子18β_甘草次酸外，其余步骤同上。
[0013]本发明得到的以金属离子为桥接剂的18β_甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱可应用于18β_甘草次酸的分离和富集。
[0014]本发明以金属离子作为金属桥接剂制备18β_甘草次酸分子印迹聚合物，具体的是以乙酸钴作为金属离子桥接剂，以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，Ν，Ν_ 二甲基甲酰胺和二甲基亚砜作为三元致孔剂，合成具有预定选择性的18β_甘草次酸印迹聚合物。该制备方法容易操作，制备过程简单，并通过调整模板单体比例，交联剂含量等获得具有明显印迹效果的聚合物(印迹因子为3.50),和不加金属离子的印迹聚合物做对比，印迹因子提高了近3倍。此外，将合成好的聚合物干燥、研磨、过筛(74μπι)后作为吸附剂装填在聚丙烯固相萃取柱中，通过分子印迹固相萃取技术，对甘草次酸粗提物中的18β_甘草次酸进行分离富集。通过对淋洗溶剂和洗脱溶剂的考察，建立较好的分离富集甘草次酸提取液中18β-甘草次酸的方法。本发明中选用乙腈:水=5:5(ν/ν)作为淋洗溶剂，纯甲醇作为洗脱溶剂，得到样品回收率为91.1%，获得样品的纯度为93.8%。
【附图说明】
[0015]图1为本发明制备的含有金属离子及不含有金属离子的容量因子(k)和印迹因子(IF)对比图。
[0016]图2为本发明含金属离子印迹聚合物和非印迹聚合物的氮吸附测试图。
[0017]图3为本发明固相萃取中淋洗溶剂的选择。
[0018]图4为本发明制备的以金属离子作为桥接剂的分子印迹聚合物作为固相萃取吸附剂，甘草次酸提取液经SPE吸附后的HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件;所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0020]实施例1
以金属离子作为桥接剂和不含金属离子的18β_甘草次酸为模板的分子印迹整体柱的制备及其印迹因子的对比。具体步骤如下:
原位聚合法制备18β-甘草次酸印迹整体柱:
a.将质量百分数模板18β-甘草次酸3.09 %，桥接剂乙酸钴1.64 %，功能单体4-乙烯基吡啶2.76 %，引发剂偶氮二异丁腈0.29 %，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯26.04 %，溶于致孔剂为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐43.59 %、仏1二甲基甲酰胺3.32 %，二甲基亚砜19.27 %的混合致孔剂溶液中；超声溶解30 min，使之溶解、澄清，之后通入氮气，除去预聚合混合液中的氧气，再将预聚合混合液注入不锈钢柱(100 X 4.6 mm 1.D.)中，将两端封住，于50-60 °C水浴中反应16-18 ho
[0021](将上述预聚合混合液注入密封容器中，于50-60°C水浴中反应16-18 h，得到金属离子为桥接剂的18β_甘草次酸分子印迹聚合物)。