一种芳香化酶基因工程菌及构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因的克隆与表达领域，涉及一种芳香化酶基因工程菌及构建方法。
【背景技术】
[0002] 芳香化酶(Aromatase，CYP19)是细胞色素 P450酶家族中的一员，是雌激素合成过 程中最后一步的限速酶，能催化睾酮和雄烯二酮不可逆的转化为雌激素，是雌激素生物合 成过程中的关键酶。现有研究表明，芳香化酶的表达及其功能的调节会使雌激素的生成量 发生显著变化，同时可干扰局部或系统的雌激素水平。因此，芳香化酶成为治疗乳腺癌的理 想靶点，也是用于检测芳香化酶抑制剂对芳香化酶的抑制活性的常用酶。
[0003] 在芳香化酶抑制剂研究中所用的芳香化酶多来源于胎盘，胎盘来源受限且芳香化 酶是膜蛋白，难以分离纯化，因此芳香化酶基因的异源表达是大量获得芳香化酶的最佳方 法。F Zhang等人曾报道在大肠杆菌中表达过芳香化酶，但大肠杆菌在蛋白质翻译后缺乏加 工机制，其表达的重组芳香化酶在大肠杆菌中以包涵体形式存在，需变性再复性才具有活 性，收率低且步骤繁琐。Sigle和Nelson等人在昆虫细胞中表达过芳香化酶，Pompon等人在 酿酒酵母中表达过芳香化酶，但他们所表达的芳香化酶均为胞内酶，不仅产率较低，遗传稳 定性差，而且难以分离纯化。
[0004] 毕赤酵母在蛋白质翻译后能对蛋白进行加工、折叠、翻译后修饰等，毕赤酵母表达 系统在试验操作上与大肠杆菌及酿酒酵母一样简单，而且它与昆虫细胞或酿酒酵母等其它 真核表达系统相比表达水平更高。
[0005] 芳香化酶的N端前45个氨基酸为跨膜区，在异源胞外表达芳香化酶时常采用N端替 换或删除前45个氨基酸的方法来实现。本发明采用PCR技术克隆了删减了 N端前45个氨基酸 残基的芳香化酶的主功能区并转入毕赤酵母中，以实现芳香化酶在毕赤酵母中的胞外表 达。
[0006] 脊椎动物体内芳香化酶含量较低，不仅较难分离纯化，而且提取成本较高。原核表 达产物缺乏芳香化酶催化活性，其表达产物必须经过变性后再复性才具有活性，收率低且 步骤繁琐。昆虫细胞表达系统表达芳香化酶成本高且收率低，酿酒酵母表达系统表达芳香 化酶容易过糖基化，且表达水平没有毕赤酵母高。本发明提供了一种芳香化酶在毕赤酵母 中胞外活性表达的方法，为芳香化酶的表达提供一种新的途径。通过检索，目前尚未发现有 在毕赤酵母中表达芳香化酶的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供芳香化酶基因工程菌及构建方 法。本发明所构建的重组毕赤酵母基因工程菌具有良好的遗传稳定性，且表达的芳香化酶 具有活性，为芳香化酶的产业化和在乳腺癌药物研发奠定了优良的基础。
[0008] 本发明实现目的的技术方案是：
[0009] -种产芳香化酶的基因工程菌，工程菌的宿主菌为毕赤酵母，含有如序列1所述的 芳香化酶的基因序列。
[0010] 而且，所述基因的载体为质粒pPIC9K_aromatase。
[0011] 产芳香化酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下
[0012] ⑴通过PCR技术克隆了人类芳香化酶基因，克隆的芳香化酶基因为删减了N端前45 个氨基酸残基的芳香化酶的主功能区；
[0013] ⑵构建该基因的重组质粒并转入毕赤酵母中，将重组菌转接到培养基中培养并用 甲醇诱导其尚效表达；
[0014] ⑶发酵60小时后，分离菌体和发酵液，用超滤管初步浓缩发酵液；
[0015] ⑷通过SDS-PAGE蛋白电泳检测发酵液中是否有目的蛋白，最后按照相应的酶活测 定方法检测重组蛋白的活性。
[0016] 本申请所述产芳香化酶的基因工程菌发酵获得的芳香化酶。
[0017] 本发明的优点和积极效果是：
[0018] 1、本发明提供了一种胞外表达芳香化酶的方法，该方法简单有效，构建的毕赤酵 母基因工程菌成功的胞外表达了具有功能活性的芳香化酶，能为后期研究芳香化酶抑制剂 提供所需蛋白。
[0019] 2、本发明所构建的重组毕赤酵母基因工程菌具有良好的遗传稳定性，且表达的芳 香化酶具有活性，为芳香化酶的产业化和为抗乳腺癌药物的研发奠定了优良的基础。
【附图说明】
[0020] 图1为重组质粒pPIC9K_aromatase的构建；
[0021 ]图2为pMD19-T_aromatase重组质粒的单酶切验证；M:maker(10kb)，1:pMD19_T_ aromatase单酶切结果；
[0022] 图3为pPIC9K_aromatase重组质粒的单酶切验证；M:maker(10kb)，1:pPIC9K_ aromatase单酶切结果；
[0023] 图4为重组工程菌基因组PCR琼脂糖凝胶电泳检测图;M:maker(10kb)，1:工程菌基 因组PCR电泳结果；
[0024] 图5为重组菌发酵液和Pichia pastoris GS115发酵液的SDS-PAGE检测图；M: maker(245KD)，1:重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K_aromatase的发酵液，GS115 : P.pastoris 65115^^比91(发酵液。
[0025] 图6为重组芳香化酶对MFC转化的测定结果。
【具体实施方式】
[0026] 下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发 明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。
[0027] 本发明根据Bulun SE等报道的基因序列，通过PCR技术克隆了人类芳香化酶基因， 芳香化酶的N端前45个氨基酸残基为膜结合多肽，本发明所克隆的芳香化酶基因为删除N端 前45个氨基酸残基的芳香化酶的主功能区。构建该基因的重组质粒并转入毕赤酵母中，将 重组菌转接到培养基中培养并用甲醇诱导其高效表达，发酵60小时后，分离菌体和发酵液， 用超滤管初步浓缩发酵液，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测发酵液中是否有目的蛋白，最后按 照相应的酶活测定方法检测重组蛋白的活性。
[0028]具体操作方式及步骤如下：
[0029] 实施例1:
[0030]人类芳香化酶基因的克隆
[0031]根据Bulun SE等报道的基因序列，通过PCR技术克隆了删除N端前45个氨基酸残基 的芳香化酶基因的主功能区，并分别设计了上下游引物9KD45F-SnaBI和9KD45R-N〇tI。并在 该引物的末端添加了 SnaBI和Notl限制性酶切位点。
[0032] 9KD45F-SnaBI:5，-TACGTAAGCATCCCGGGTCCGGGCTAC-3，
[0033] 9KD45R-NotI：5;-GCGGCCGCTTAATGTTCCAGACAACGATCACTGTTG-3 ;
[0034]以人类芳香化酶基因为模板，通过PCR技术克隆了删减了 N端前45个氨基酸的芳香 化酶的主功能区。PCR扩增条件为:94°C5分钟，94°C30秒，64°C40秒，72°C90秒，30个循环，72 °C延伸10分钟。
[0035] 实施例2:
[0036]毕赤酵母胞外表达的重组质粒的构建
[0037] 将PCR产物与载体质粒PMD19-T进行连接反应，再将载体转化至菌株E.coli BL21 (DE3)中，并接种到含Amp的LB平板上，因为重组质粒pMD19-T_aromatase含Amp抗性基因，所 以导入了重组质粒的大肠杆菌也具有Amp抗性，本发明根据是否带有Amp抗性来筛选重组 子，在Amp抗性平板上可以生长的就是构建成功的重组子。从LB固体平板上挑取单菌落转接 到LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，用限制性内切酶