包含突变体spr基因且具有降低的tsp活性的细菌宿主菌株的制作方法
【专利说明】包含突变体SPR基因且具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株
[0001 ] 本申请是申请日为2011年1月13日、申请号为201180009682.7、发明名称为"包含 突变体SPR基因且具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本发明设及重组细菌宿主菌株，特别是大肠杆菌化.Coli)。本发明还设及在此细 胞中产生目的蛋白质的方法。
[0003] 发明背景
[0004] 通常将细菌细胞，如大肠杆菌，用于生产重组蛋白质。使用细菌细胞如大肠杆菌生 产重组蛋白质有很多优势，具体而言是因为细菌细胞作为宿主细胞的多样属性使得通过质 粒进行基因插入。大肠杆菌已经用于很多重组蛋白质的生产，包括人膜岛素。
[000引尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有很多优势，但是仍然有显著的局限性，包括 难于产生蛋白酶敏感型蛋白质。蛋白酶在大肠杆菌细胞周质和细胞质中对于转换老旧、受 损或错误折叠的蛋白质起重要作用。细菌蛋白质起降解目的重组蛋白质的作用，因此常常 显著降低活性蛋白质的产量。
[0006] 已经鉴定出大量细菌蛋白酶。在大肠杆菌中蛋白酶包括蛋白酶III(ptr)、DegP、 OmpT、Tsp、prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpP及Ion。
[0007] Tsp(也称为化c)为一种60kDa的细胞周质蛋白酶。第一种已知的Tsp底物为青霉素 结合蛋白质一3(PBP3)(Determination of the cleavage site involved in C-termi打al processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli；Nagasawa H, Sakagami Y,Suzuki A,Suzuki H,Hara H,Hirota Y.J Bacteriol.1989 Nov；171(11): 5890-3?及Cloning.mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3；Kara H,Yamamoto Y,Higashitani A,Suzuki H,Nishimura Y.J Bacteriol.1991Aug; 173(15) :4799-813),但是之后发现Tsp也能够裂解隧菌体尾己蛋白质并因此重命名为尾己 特异性蛋白酶（Tsp) (Si 化 er 等人，Proc.化 tl. Acad. Sci. USA, 89:295-299( 1992)) eSnber 等人（Deletion of the prc(tsp)gene provides evidence for 曰ddition曰 1 t曰il-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12;Silber,K.R.,Sauer, R.T.;Mol Gen Genet 1994 242: 237-240)描述了一种prc删除菌株化S1000 )，其中突变是 由W包含Kant标志物的片段取代prc基因的片段而产生的。
[0008] Tsp(prc)活性降低对降低目的蛋白质的蛋白质水解是可取的。然而，发现缺少蛋 白酶prc的细胞在低渗透压下显示出热敏感生长概况。化ra等人分离了耐热性回复突变株， 其含有基因外抑制子（spr)突变（Hara等人，Microbial Drug Resistance,2:63-72 (1996))DSpr为18kDa的膜结合细胞周质蛋白酶，spr的底物为TspW及外膜中参与细胞分裂 中细胞壁水解的肤聚糖。spr基因标记为UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_EC0LI)。
[0009] 已经描述了包含突变的spr基因的改良的蛋白酶缺陷细菌菌株。Chen等人描述了 携带prc(Tsp)及另一种蛋白酶De评中不同突变组合的大肠杆菌菌株的构建，是通过扩增基 因上游及下游区域并将其一同连接于包含选择标记物及spr W174R突变的载体上产生的。 重组抗体片段在大肠埃希氏菌的细胞周质中的高水平积累需要Ξ重突变（Δ DegP Δ prc spr W174R)的宿主菌株（畑en C,Snedecor B,Nishihara JC,Joly JC.McF'arland N, Andersen DC,Battersby JE,Qiampion KM.Biotechnol Bioeng.2004 Mar 5;85(5):463-74)。发现Δ De评，Δ prc和spr W174R突变的组合能够提供最高水平的抗体轻链、抗体重链 及尸(曰6'）2-1^2。6?1341899公开了分别在编码蛋白酶〇6评及?'(3的染色体〇6评及9'(3上有缺 陷的大肠杆菌菌株，其还具有突变的spr基因，该基因编码的蛋白质抑制具有prc突变体的 菌株表现出来的生长表型。
[0010]本发明提供了新型细菌菌株，其携带的备选的spr突变体，为重组蛋白质的生产提 供了有利的方式。
[001。 发明概述
[0012] 在本发明的第一方面，提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变的spr基因， 所述突变的 spr 基因编码在选自 N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、 0133、￥135、1^36、6140、1?144、刖45、6147和刖57的一个或多个氨基酸处有突变的39'蛋白 质，且其中所述细胞具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性。
[0013] 在一个实施方式中，除了突变的spr基因 W及使Tsp蛋白质活性相比于野生型细胞 有所降低所需的修饰外，细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基因的（isogenic)。
[0014] 在第二方面，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其具有相比于野生型细胞 降低的Tsp蛋白质活性并包含编码spr蛋白质的突变的spr基因，其中除了使Tsp蛋白质活性 相比于野生型细胞有所降低所需的修饰W及突变的spr基因外，细胞的基因组与野生型细 菌细胞是同基因的。
[0015] 本发明的第一和第二方面提供的细胞显示出优势的生长W及蛋白质生产表型。
[0016] 在第Ξ方面，本发明提供了用于生产目的蛋白质的方法，包括在如上文限定的重 组革兰氏阴性细菌细胞中表达目的蛋白质。
[0017] 附图简述
[0018] 图1显示了相比于表达抗-TNFa化b'的野生型W3110和MXE001菌株，表达抗-TNFa 化b'的MXE008和MXE009的生长概况。
[0019] 图2显示了相比于野生型W3110和MXE001，在MXE008和MXE009菌株中抗-TNFa化b ' 的表达情况。
[0020] 图3显示了相比于表达抗-TNFa化b'的菌株对照W3110和MXE001，表达抗-TNFa 化b'的MXE008和MXE009的生长概况。
[0021 ] 图4显示了相比于对照W3110和MXE001，大肠杆菌MXE008和MXE009的细胞周质（阴 影标记及上清(空屯、非阴影标记）中抗-TN阳化b'的产量。
[0022] 图5显示了相比于表达抗-TNFa化b'的野生型菌株W3110和MXE001，表达抗-TNFa 化b '的MXE0012和MXE017的生长概况。
[0023] 图6显示了相比于野生型W3110和MXE001，在MXE0012和MXE017中抗-TNFa化b'的 表达情况。
[0024] 图7显示了在生产抗-TNFa化b'的发酵中W3110、MXE001和MXE008的生长概况。
[0025] 图8显示了在生产抗-TNFa 化b'的发酵中W3110、MXE001( Atsp)和MXE008( Atsp spr D112A)的细胞周质抗-TNFa化b'积累（实线及标记及培养基抗-TNFa化b'积累（虚 线及空屯、标记）。
[0026] 图9显示了菌株胖3110、]\?6001、]\?6008和]\?6012的(130臟测定的结果。
[0027] 图10显示了菌株胖3110、]\?6001、]\?6008和]\?6012的蛋白质测定的结果。
[0028] 图11a显示了野生型ptr(蛋白酶III)和敲除突变的ptr(蛋白酶III)的蛋白质及基 因序列的5'末端。
[0029] 图Ub显示了野生型Tsp和敲除突变的Tsp的蛋白质及基因序列的5'末端。
[0030]图11c显示了野生型De评及突变的De评蛋白质及基因序列的区域。
[0031 ] 序列简述
[003引 SEQ ID NO: 1是野生型Tsp基因的DNA序列，包括起始密码子上游的6个核巧酸 ATGAACo
[0033] SEQ ID N0:2是野生型Tsp蛋白质的氨基酸序列。
[0034] SEQ ID NO:3是突变的敲除Tsp基因的DNA序列，包括起始密码子上游的6个核巧酸 ATGAATo
[003引 SEQ ID N0:4是野生型蛋白酶IΠ 基因的DNA序列。
[0036] SEQ ID NO:5是野生型蛋白酶HI蛋白质的氨基酸序列。
[0037] SEQ ID N0:6是突变的敲除蛋白酶IΠ 基因的DNA序列
[003引 SEQ ID ^:7是野生型06评基因的0臟序列。
[0039] SEQ ID N0:8是野生型De评蛋白质的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID ^:9是突变的〇6评基因的0臟序列。
[0041 ] SEQ ID NO: 10是突变的De评蛋白质的氨基酸序列。
[0042] SEQ ID NO: 11是抗-TNF抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
[0043] SEQ ID NO: 12是抗-TNF抗体的重链可变区的氨基酸序列。
[0044] SEQ ID ^:13是抗-了肥抗体的轻链的氨基酸序列。
[004引 SEQ ID ^:14是抗-了肥抗体的重链的氨基酸序列。
[0046] SEQ ID NO: 15是用于突变的Tsp基因区域的3'寡核巧酸引物的序列，包含Ase I限 制性位点。
[0047] SEQ ID NO: 16是用于突变的Tsp基因区域的5'寡核巧酸引物的序列，包含Ase I限 制性位点。
[0048] SEQ ID N0:17是用于突变的蛋白酶III基因区域的3'寡核巧酸引物的序列，包含 Ase I限制性位点。
[0049] SEQ ID N0:18是用于突变的蛋白酶III基因区域的5'寡核巧酸引物的序列，包含 Ase I限制性位点。
[0050] SEQ ID NO: 19是用于突变的De评基因区域的5'寡核巧酸引物的序列，包含Ase I 限制性位点。
[0051 ] SEQ ID N0:20是用于突变的De评基因区域的3'寡核巧酸引物的序列，包含Ase I 限制性位点。
[0052] SEQ ID NO: 21是野生型spr基因的序列，包括信号序列，即，前26个氨基酸残基。
[0053] SEQ ID NO: 22是非突变的spr基因序列，不包括信号序列。
[0054] 沈Q ID ^:23是突变的〇11191'序列的核巧酸序列，包括021(^和肥124突变。
[00巧]SEQ ID ^:24是突变的〇11191'序列的氨基酸序列，包括021(^和肥124突变。
[0056] SEQ ID N0:25是突变敲除的OmpT序列的核巧酸序列。
[0057] SEQ ID ^:26显示了^肥40的〔0畑1的氨基酸序列。
[005引 SEQ ID顯:27显示了^^40的00畑2的氨基酸序列，其为杂合〔03，其中(：-端六个 氨基酸来自人亚群巧中系抗体化uman subgroup 3)的H2CDR序列，且由此杂合产生的序列中 氨基酸变化由下划线标出，如下:WINTYIGEPI Y耸D哥KG。
[0059] SEQ ID ^:28显示了^肥40的〔0畑3的氨基酸序列。
[0060] SEQ ID ^:29显示了^肥40的〔0化1的氨基酸序列。
[0061] SEQ ID ^:30显示了^肥40的〔0化2的氨基酸序列。
[0062] SEQ ID ^:31显示了^肥40的〔0化3的氨基酸序列。
[0063] SEQ ID ^:32显示了^肥40的〔0畑2的氨基酸序列。
[0064] SEQ ID N0:33显示了0mpA寡核巧酸转接子的序列。
[0065] SEQ ID N0:34显示了编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列l(IGSl)的寡核巧 酸盒。
[0066] SEQ ID N0:35显示了编码用于大肠杆菌化b表达的基因间序列2(IGS2)的寡核巧 酸盒。
[0067] SEQ ID N0:36显示了编码用于大肠杆菌化b表达的基因间序列3(IGS3)的寡核巧 酸盒。
[006引 SEQ ID N0:37显示了编码用于大肠杆菌化b表达的基因间序列4(IGS4)的寡核巧 酸盒。
[0069] 本发明优选实施方式详述
[0070] 本发明人提供了适合于表达目的蛋白质的重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变 的spr基因，且所述细胞具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性。
[0071] 在本发明的第一个方面，对spr的新突变提供了新型菌株，相比于野生型细菌细胞 W及携带突变的Tsp基因的细胞，所述新型菌株具有改善的细胞生长表型。
[0072] 本发明人已经鉴定出新的spr突变，其能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的生长 表型。本发明人出乎意料地发现，相比于野生型细胞或包含突变的Tsp基因的细胞，携带新 的突变的spr并具有降低Tsp活性的细胞显示出增加的细胞生长速率且细胞存活时间有所 增加。具体地，相比于携带突变的Tsp基因的细胞，携带所述新的spr突变并具有降低的Tsp 活性的细胞显示出降低的细胞裂解表型。因此，相比于携带突变的Tsp基因的细胞，新菌株 减少了细胞中的蛋白质渗漏并延长了细胞周质中蛋白质的积累。
[0073] 进一步地，与野生型细菌细胞或包含突变的Tsp基因的细胞相比，携带新的突变的 spr并具有降低的Tsp活性的细胞显示出目的蛋白质产量的提高。提高的蛋白质产量可W是 细胞周质蛋白质产量和/或上清蛋白质产量。在一个实施方式中，由于细胞渗漏减少，携带 突变的Tsp基因的细胞相比，本发明的细胞与显示出提高的细胞周质蛋白质产量。重组细菌 细胞能够W更快的速率产生目的蛋白质，因此，相比于野生型细菌细胞或包含突变的Tsp基 因的细胞，相同量的目的蛋白质可在更短的时间内产生。目的蛋白质更快的生产速率在细 胞生长起始阶段意义尤其显著，例如在诱导蛋白质表达后的前5、10、20或30小时。
[0074] 根据本发明的细胞优选地在细胞周质和/或培养基中表达的目的蛋白质的最大产 量为大约 1.0邑/1、1.5邑/1、1.8邑/1、2.0邑/1、2.4邑/1、2.5邑/1、3.0邑/1、3.5邑/1或4.0邑/1。
[0075] 本发明的第一和第二方面提供的细胞相比于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白酶活 性，运可W降低目的蛋白质(尤其是那些对Tsp具有蛋白水解敏感性的目的蛋白质）的蛋白 水解。因此，相比于野生型细菌细胞，本发明的第一和第二方面提供的细胞可W提供更高产 量的完整蛋白质(优选地为目的蛋白质），并提供较低产量的或优选地不产生蛋白质(优选 地为目的蛋白质）的蛋白水解片段。
[0076] 在本发明的第二方面及本发明第一方面的优选实施方式中，细胞只携带引入一种 或多种spr突变所需的基因组最小突变W及相比于野生型细胞降低Tsp蛋白质活性所需的 修饰。细菌细胞与野生型细菌细胞基因组的差异只有对spr基因的一种或多种突变W及相 比于野生型细胞降低Tsp蛋白质活性所需的修饰。细胞不携带任何其他可W对细胞生长和/ 或表达目的蛋白质能力有不利作用的突变。因此，相比于包含对基因组序列有进一步遗传 工程改造突变的细胞，本发明的一种或多种重组宿主细胞展示了改进的蛋白质表达和/或 改进的生长特征。相比于包含对细胞基因组的其他破坏的细胞，本发明提供的细胞还更适 合于用于产生治疗性蛋白质。
[OOW]本发明技术人员可容易地使用本领域熟知的方法(包括发酵方法、ELISA及蛋白质 G HPLC)，测试候选的细胞克隆W确定其是否具有目的蛋白质的所需要产量。合适的发酵方 法描述于Humphreys D P等人（1997) cFormation of dimeric Fabs in E. coli : effect of hinge size and isotype.presence of interchain disulphide bond,Fab'expression levels,tail piece sequences and growth conditions.J.IMMUNOL.METH.209:193-202； Backlund E.Reeks D.Markland K.Weir N.Bowering L.Larsson G.Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli,Journal Article. Research S叫port,Non-U.S.Gov't Journal of Biotechnology.135(4):358-65,2008 Jul 31; Champion KM.Nishihara JC.Joly JC.Arnott D.Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Journal Article ]P;roteomics .1(9):1133-48,2001 Sep; W 及 Horn U.Strittmatter W.Krebber A.Knupfer U.Kujau M.Wenderoth R.Muller K.Matzku S.Pluckthun A.Riesenberg D.High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli,using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions Journal Article.Research Support,Non-U.S.Gov't Applied Microbiology&Biotechnology.46 (5-6):524-32,1996 Dec。本领域技术人员还可容易地使用本领域熟知方法，如蛋白质G HPLC、圆二色谱、NMR，X-光晶体成像及表位亲和力测量方法，测试分泌蛋白质W确定蛋白质 是否正确折叠。
[0078] 现在将W更详细的方式描述本发明。除非另有具体陈述，本文描述的所有实施方 式指的是本发明的第一、第二及第Ξ个方面。
[0079] 除非上下文另有说明，术语"蛋白质"和"多肤"在本文交换使用。"肤"意欲指代10 个或更少的氨基酸。
[0080] 除非上下文另有说明，术语"多核巧酸"包括基因、0臟、〇0臟、3酷、1111?酷等。
[0081] 如本文所使用的，术语"包含"在本说明书的上下文中应解释为"包括"。
[0082] 在本发明的上下文中，非突变的细胞或对照细胞指的是与本发明重组革兰氏阴性 细胞相同类型的细胞，其中所述细胞未被修饰为携带上文所述的降低的Tsp蛋白质活性及 携带突变的spr基因。例如，非突变的细胞可为野生型细胞，并可与本发明细胞在进行修饰 引入任何突变之前衍生自相同的宿主细胞群体。
[008引词句"细胞'、"细胞系"、"细胞培养物"及"菌株"可交换使用。
[0084]词句"包含突变的Tsp基因的细胞的表型"在本发明上下文中指的是带有突变的 Tsp基因的细胞所表现出的表型。一般地，包含突变的Tsp基因的细胞会裂解，尤其是在高细 胞密度下。运些细胞的裂解引起任何重组蛋白质渗漏入上清。携带突变的Tsp基因的细胞还 可W显示出在低渗透压下的热敏型生长。例如在高溫(如40°C或更高）下，在低渗培养基中， 细胞显示不出生长速率或生长速率降低，或者细胞死亡。
[008引术语"同基因的"在本发明的上下文中指的是与所述细胞来源的野生型细胞相比， 本发明细胞的基因组除了突变的spr基因 W及与野生型细胞相比降低Tsp蛋白质活性所需 的修饰W外具有几乎相同或相同的基因组序列。在此实施方式中，所述细胞基因组不包含 其他非天然发生的或遗传工程改造的突变。在一个实施方式中，考虑到任何可W发生的天 然发生的突变，与野生型细胞相比，根据本发明的细胞除了突变的spr基因 W及与野生型细 胞相比降低Tsp蛋白质活性所需的修饰W外具有几乎相同的基因组序列。在一个实施方式 中，与野生型细胞相比，根据本发明的细胞除了突变的spr基因 W及与野生型细胞相比降低 Tsp蛋白质活性所需的修饰W外具有完全相同的基因组序列。