一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞工程、组织工程与生物起搏等领域，特别是涉及极小胚胎样干细胞分离与纯化领域。
【背景技术】
[0002]极小胚胎样干细胞(verysmall embryonic-like stem cells，VSELs)是一类体积非常细小、数量极少(占骨髓单个核细胞的0.01% - 0.04%)、具有多能性的非造血干细胞。VSELs于2006年由美国肯塔基州路易斯维尔大学Mariusz Ratajczak等人从小鼠骨髓单个核细胞中成功分离并命名，细胞表型为Sca-l(+)lin(_)⑶45(_)，直径2-4μπι。该团队进一步研究发现人骨髓、脐带血、外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等组织中同样存在，细胞表型为SSEA-4+/0ct-4 +/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-，直径为 4-6μπι。人和鼠 VSELs 的生物学特性主要包括:较血小板大，红细胞小，细胞核大，含常染色质，表达原始多能干细胞标志Oct-4和Nanog，具有多分化潜能特性，与胚胎干细胞(ESCs)或诱导的胚胎样干细胞(iPSs)有相似之处，即能在体内分化为所有三种胚系的细胞如血细胞、骨细胞、肌细胞和神经细胞等。该细胞与衰老有关，随着年龄的增长其含量会进一步的降低，并且在体外单独培养的情况下很难扩增。由于VSELs可以向三个胚层分化，且无免疫排异、无伦理问题，被认为具有替代胚胎干细胞的潜力，其在科学界深受重视。已表明在心肌梗塞的鼠动物模型以及心肌梗塞和中风患者中循环水平大大增加，也显示出VSELs在体内修复损伤心肌、骨骼、胰岛、神经组织和免疫系统的有效性。尽管有人推测VSELs有可能改变再生医学，但鉴于VSELs是体内非常稀少的成体多能干细胞，分离、培养技术复杂，而且正如加州斯坦福大学Weissman、波兰亚捷隆大学的Dulak等教授按照Ratajczak团队最初所描述的方法重复实验并广泛分析，却无法从鼠的骨髓、人的脐带血中分离到极小的胚胎样干细胞，或者在直径小于7微米的老鼠骨髓细胞中，未能发现与多能性有关的分子标签，纷纷质疑其存在和价值，因此，如何改进分离与纯化技术是VSELs研究中急需解决的问题。
[0003]因VSELs体积小、数量少和贴壁能力弱，通常的骨髓非造血干细胞分离方法即贴壁分离法和密度梯度离心法所获取的细胞得率相当低，故不适合VSELs的分离。红细胞裂解法、流式细胞分选法或免疫磁珠分选法虽可以用于人和鼠VSELs的分离，但单独一种方法均不能达到满意效果，单纯采用免疫磁珠法，细胞繁杂，纯度不够;单纯采用流式分选尤其是处理大量细胞样品需达到一定数量的目标细胞，一次须24-36小时，易损伤和污染细胞。另夕卜，迄今为止，尚缺乏大型偶蹄动物VSELs的分离或纯化报道。
【发明内容】
[0004]针对目前极小胚胎样干细胞制备难度大、周期长、效率低、纯度不高，且上述任何一种方法均不能达到满意的效果，本发明提供了一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法，包括以下步骤:
(I)猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RMPI 1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个核细胞；
(2)按照IX 18/10ul细胞浓度加入FcR封闭液，耦合⑶133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，过柱分选，获得猪骨髓⑶133(+)或Lin(-)细胞群；
(3)采用⑶133、⑶45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓⑶133( + ) Lin (-)CD45 (_)极小胚胎样干细胞。
[0005]本发明将红细胞裂解法、免疫磁珠分选法(MACS)和流式细胞分选术(FACS)三道程序科学组合，50ml猪骨髓液分离时间缩短至4-6小时，纯度达到95%以上、细胞得率高、细胞数量达到I X 15以上。与采用红细胞裂解法和经典流式细胞分选(公开号103396988A)相比效率提高3-4倍，单纯采用流式分选如达到一定数量级的目标细胞，每次须24-36小时、耗时长，细胞大量损伤且少量VSELs有可能已分化为较成熟细胞;与采用某一种单抗磁珠分选法(公开号102229910A)相比纯度显著增高。发明提出的高效VSELs的分离、方法具有巨大的应用前景，为VSELs的临床研究提供了重要的技术保障。
[0006]作为本方法的优选，采用红细胞裂解法分离猪骨髓总单个核细胞，首先将适龄猪麻醉固定在清洁工作台上，无菌操作下于猪髂后上棘或髂前上棘行骨髓穿刺术，获得足够量并充分肝素化的骨髓，离心去脂，加入红细胞裂解液，吸除上清液，4°C下加入0.02%EDTA洗涤得细胞悬液。用含2%FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，轻轻吹打，4°C下500rpm离心10分钟。用2ml含2% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，经40um滤网过滤后分离，进而离心、洗涤、过滤、去除碎片后得到总单核细胞。
[0007]作为本方法的优选，所选取用于麻醉的适龄猪为2-4月龄的小型成体猪，体重(35±5kg)，雌雄不限，由扬州农业大学实验动物中心提供，所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。实验方案获得扬州大学实验动物伦理委员会和江苏省苏北人民医院伦理委员会批准。
[0008]作为本方法的优选，所述的获得猪骨髓CD133(+)细胞群，步骤包括:
(1)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液4°C下500 rpm离心10分钟，按照I X 108/300ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞，按照I X 108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2)加⑶133抗体免疫磁珠标记细胞
按照I X 108/100ul细胞浓度加入耦合⑶133抗体的免疫磁珠标记细胞。充分混匀，2°C?8°C孵育30分钟。按照I X 108/2ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4°C500 rpm离心10分钟。小心吸除上清液后按照I X 108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；
(3)细胞过柱免疫磁珠分选获得⑶133(+)细胞将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每Iml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入Iml细胞悬液，待细胞悬液流尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液Iml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱内磁珠结合的细胞即为⑶133(+)细胞。
[0009]作为本方法的优选，所述的获得猪骨髓Lin(-)细胞群，步骤包括:
(I)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液，4°C下500 rpm离心10分钟，按照I X 108/400ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞。按照I X 108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液； (2)加Lin抗体免疫磁珠标记细胞
按照lX 108/100ul细胞浓度加入耦合Lin抗体的免疫磁珠，标记细胞。充分混匀，2°C?8°C孵育30分钟。按照I X 108/5ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4°C500 rpm离心10分钟。小心吸除上清液后按照I X 108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；
(3)细胞过柱免疫磁珠分选获得Lin(-)细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每Iml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL浸润分选柱，注入Iml细胞悬液，细胞悬液过柱后冲洗分选柱三次，每次加入Iml缓冲液，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，无菌管中细胞悬液即为Lin(-)细胞群。
[0010]作为本方法的优选，采用流式细胞术分选获得猪骨髓极小胚胎样干细胞，以17/10uL细胞浓度分别加入⑶133标记、CD45标记、Lin标记和⑶133/⑶45/Lin标记，将确定好尺寸的微珠(1、2、4、6、10和15μπι)，按顺序运行于流式细胞仪上，即可以分选出⑶133( + )Lin(_)CD45(_)合格的极小胚胎样干细胞。将流式分选后得到的VSELs加到无饲养层细胞的培养板中，置于37°C、5% 0)2的培养箱中，同时添加双抗(青-链霉素储存液)，1^』?6?、50?等细胞因子的RPMI 1640条件培养基进行培养。
[0011 ]作为本方法的进一步优选，所述的红细胞裂解液是由FACS溶血素与超纯水按照体积比1:10比例混匀，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，使用时预热至室温。
[0012]作为本方法的进一步优选，所述的I3BS缓冲液(不含0&、1%)，是取他2即04.12H201.4425g，KH2P04 0.lg,NaCl 4g，KCl 0.lg，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，4°C冰箱中保存。
[0013]作为本方法的进一步优先，所述的0.02%EDTA，是将0.02gEDTA溶于10mLPBS缓冲液中，将PH调整至7.2后使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20°C冰箱中备用。
[0014]作为本方法的进一步优选，CD133抗体的免疫磁珠为CD133 MicroBead Kit-Hematopoietic Tissue。
[0〇15] 作为本方法的进一步优选，Lin抗体的免疫磁珠为Lineage Cell Deplet1n kit。
[0016]作为本方法的进一步优选，荧光素标记的抗体原液为PerCP-Cy5.5-anti_CD45单克隆抗体、ant1-Lin-FITC单克隆抗体和ant1-CD133/2PE单克隆抗体。
[0017]作为本方法的进一步优选，所述的双抗(青-链霉素储存液):取青、链霉素各100万单位溶10mLPBS缓冲液中。
[0018]为实施本方法，涉及到的主要实验仪器，包括超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置荧光显微镜、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡仪、冰箱、电子天平制冰机、超纯水设备、免疫磁珠分选仪、流式细胞仪、581OR型低温高速离心机。
[0019]为实施本方法，涉及到的主要实验器械，包括(I)手术器械