分离外周血免疫细胞的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种外周血免疫细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002]目前的梯度离心分离方法步骤繁琐，技巧性较强，对操作者的经验要求比较高:梯度离心分离需要三步，尤其是第二步，要在高密度的分离液上小心翼翼的铺上低密度的细胞悬液而不能弄混界面，这极大的考验操作者的经验和耐心，费时费力，容易疲劳，而一旦弄混液面，分离效果将大受影响，甚至分离不出淋巴细胞层。而且目前的分离液多有一定的毒性，影响分离效果和分离后的细胞质量，导致分离效率较低。
[0003]而且在标准的分离过程中，细胞必须与分离液接触15-45分钟的时间，以达到最佳分离效果。在这段时间内，分离液中各组分可能通过被动扩散、细胞的主动运输、胞吞/胞饮作用、表面黏附等途径，在细胞内部蓄积，且此部分蓄积成分，很难通过常规的洗涤从分离得到的目标细胞(例如淋巴细胞)中完全去除。
[0004]因此，有必要提供一种能够提高分离效率、保证分离细胞的纯度和活性的分离方法。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种能够提高分离效率、保证分离细胞的纯度和活性的的分离外周血免疫细胞的分离方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下:
[0007]—方面，提供一种分离外周血免疫细胞的分离方法，包括如下步骤:
[0008]步骤1:将抗凝剂处理过的外周血用生理盐水或无血清培养基稀释获得细胞悬液；
[0009]步骤2:将含有葡聚糖、磷脂、海藻糖和氨基酸的分离液加入离心管中，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2;
[0010]步骤3:将所述细胞悬液铺在所述分离液上，在8-25°C，200g-800g，10?30min条件下离心，吸取白膜层细胞。
[0011]本发明使用配制的分离液时，操作者可以直接将细胞悬浮液铺设在分离液上，铺设过程无须过多考虑液面的破坏，对操作者的操作经验要求较低;本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高，而且分离得到的免疫细胞并具有较好的杀肿瘤活性;本发明分离的免疫细胞主要为淋巴细胞，本发明不仅在分离淋巴细胞分离方面效果显著，对于干细胞分离也具有很好的效果;本发明采用的葡聚糖是一种多聚糖，在输血过程中可以代替全血的一部分，常用作血浆扩充剂;磷脂，是含有磷脂根的类脂化合物，磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用;海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀;L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助。
[0012]进一步地，所述分离液的制备方法为:将符合药用标准的葡聚糖2?4重量份，磷脂0.3?3重量份，L-缬氨酸0.008-0.01重量份，L-亮氨酸0.009-0.012重量份，海藻糖5?7重量份，超低粘度海藻酸钠0.5?I重量份，泛影葡胺3?5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.04?0.1重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过滤膜过滤除菌得到分离液。
[0013]本发明采用的葡聚糖是一种多聚糖，在输血过程中可以代替全血的一部分，常用作血浆扩充剂;磷脂，是含有磷脂根的类脂化合物，磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用;海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀;L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助;本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
[0014]进一步地，所述分离液的制备方法为:将符合药用标准的葡聚糖2.5?3.5重量份，磷脂0.5?2重量份，L-缬氨酸0.008-0.01重量份，L-亮氨酸0.009-0.012重量份，海藻糖5.5?6.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.6?0.9重量份，泛影葡胺3.5?4.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.06?0.09重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。
[0015]优选地，所述分离液的制备方法为:将符合药用标准的葡聚糖3重量份，磷脂1.2重量份，L-缬氨酸0.009重量份，L-亮氨酸0.011重量份，海藻糖6重量份，超低粘度海藻酸钠
0.8重量份，泛影葡胺4重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.08重量份，充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。
[0016]进一步地，所述分离液的密度为1.070?1.090g/cm3，渗透压为275?300smol/kg，pH为6?9，粘度为3.0?5.0cp。
[0017]进一步地，所述步骤I中的灭菌水为灭菌注射用水。
[0018]进一步地，所述葡聚糖为葡聚糖T500。
[0019]进一步地，所述步骤I中的滤膜为灭菌的0.22μπι滤膜。
[0020]进一步地，所述步骤2的稀释比例为1:2-2:1。
[0021]进一步地，所述步骤2的稀释比例为1:1-1.5:1。
[0022]综上所述，本发明的有益效果表现为:
[0023]本发明使用配制的分离液时，操作者可以直接将细胞悬浮液铺设在分离液上，铺设过程无须过多考虑液面的破坏，对操作者的操作经验要求较低;本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高，而且分离得到的免疫细胞并具有较好的杀肿瘤活性;本发明分离的免疫细胞主要为淋巴细胞，本发明不仅在分离淋巴细胞分离方面效果显著，对于干细胞分离也具有很好的效果;本发明采用的葡聚糖是一种多聚糖，在输血过程中可以代替全血的一部分，常用作血浆扩充剂;磷脂，是含有磷脂根的类脂化合物，磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用;海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀;L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助。
【具体实施方式】
[0024]为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0025]实施例一
[0026]—种分离外周血免疫细胞的分离方法，包括如下步骤:
[0027]步骤1:将抗凝剂处理过的外周血用生理盐水或无血清培养基稀释获得细胞悬液；
[0028]步骤2:将含有葡聚糖、磷脂、海藻糖和氨基酸的分离液加入离心管中，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2;
[0029]步骤3:将所述细胞悬液铺在所述分离液上，在8-25°C，200g-800g，10?30min条件下离心，吸取白膜层细胞。
[0030]其中，分离液的制备方法为:在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的葡聚糖4g，磷脂3g，海藻糖5g，超低粘度海藻酸钠0.5g，泛影葡胺5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.lg，L-缬氨酸0.0lg和L-亮氨酸0.009g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0031]实施例二
[0032]—种分离外周血免疫细胞的分离方法，包括如下步骤:
[0033]步骤1:将抗凝剂处理过的外周血用生理