免疫细胞培养方法以及人工滋养细胞在免疫细胞培养中的用图
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞制备技术领域，具体涉及一种免疫细胞培养方法以及人工滋养细胞在免疫细胞培养中的用途。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是一类最为严重危害人类健康的疾病，每年全国大约三百万人诊断为新发肿瘤患者，二百多万人死于癌症。尽管可以通过手术、放疗、化疗进行治疗，但大多数病人仍死于肿瘤的复发和转移。所以，如何清除残留的微小肿瘤组织或肿瘤细胞则是现代肿瘤免疫学有待解决的问题之一。
[0003]由于癌症发生的根本原因是肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监控而进行无节制的生长，所以提高免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞的能力，将可以从根本上去除肿瘤。随着新技术在临床上的应用推广，过继性免疫细胞疗法逐渐成为治疗癌症最有效的方法之一。
[0004]过继性免疫细胞疗法是指:将肿瘤患者体内具有抗肿瘤细胞性能的免疫细胞在体外进行培养，在体外高效活化和扩增患者自身的CTL(cytotoxic lymphocyte，毒性T淋巴细胞)细胞，其中，CTL细胞是白细胞的亚部，为一种特异T细胞，对某种抗原敏感，具有对抗原阳性的靶细胞的特异性杀伤，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用，对某些肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。CTL细胞是机体抗肿瘤最主要的效应性淋巴细胞。CTL的功能优点是在相同主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)限制的条件下，特异性地识别和直接杀伤抗原阳性的靶细胞，能针对性地消除具有肿瘤抗原特异性的癌细胞。这种抗癌作用对分布在病人组织器官内的小体积肿瘤组织和个体肿瘤细胞尤为重要和有效，也是肿瘤组织细胞被清除的最后一道步骤，其在临床应用中功效已得到充分证实。
[0005]当CTL细胞在体外扩增至一定数量时，再回输至该患者体内，采用CTL细胞杀伤或杀灭肿瘤细胞等抗原物质，达到抗肿瘤的目的。
[0006]由于CTL细胞的扩增需要免疫细胞生长因子和细胞共刺激分子信号的刺激下才能复制扩增。目前传统的免疫细胞培养方法中，需要在细胞培养时不断加入免疫细胞生长因子以及细胞共刺激分子信号蛋白，由于细胞生长因子和其在细胞表面的受体结合后发生内吞过程，所以加入培养基中的外源蛋白半衰期短，需要不断定期加入免疫细胞生长因子和细胞共刺激分子信号蛋白，不仅增加了免疫细胞培养的操作复杂度，也大大增加细胞生产的成本，影响免疫细胞在癌症治疗中的推广和应用。
[0007]另外，传统的免疫细胞培养方法所培养的免疫细胞，其具有的CTL细胞的比例、对肿瘤细胞的杀伤力以及专一性均有限，进一步影响免疫细胞在癌症治疗中的推广和应用
【发明内容】
[0008]针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种免疫细胞培养方法以及人工滋养细胞在免疫细胞培养中的用途，可有效解决上述问题。
[0009]本发明采用的技术方案如下:
[0010]本发明提供一种免疫细胞培养方法，包括以下步骤:
[0011]将外周血单个核细胞重悬于培养基中进行培养，当将细胞培养至需要CTL细胞扩增的阶段时，向细胞培养液中加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞，静置培养，得到最终的免疫细胞。
[0012]优选的，所述滋养细胞表达的细胞生长因子为IL-21细胞生长因子;所述滋养细胞表达的共刺激分子为4-1BBL共刺激分子。
[0013]优选的，所述滋养细胞表达的4-1BBL共刺激分子中阳性细胞比例为100%;所述滋养细胞表达的IL-21细胞生长因子中阳性细胞比例为96.7%。
[0014]优选的，所述滋养细胞为K562细胞。
[0015]优选的，加入滋养细胞后静置培养的条件为:温度为37°C、体积百分比含量为5%且相对饱和湿度为100%的CO2培养箱中培养。
[0016]优选的，所述滋养细胞加入量与加入时刻所述细胞培养液中CTL细胞的数量比为1:8。
[0017]本发明还提供一种人工滋养细胞在免疫细胞培养中的用途，在免疫细胞培养过程中加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞进行培养，增加免疫细胞抗原专一性的比例、增加免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤力以及增加免疫细胞中CTL细胞的比例。
[0018]本发明提供的免疫细胞培养方法以及人工滋养细胞在免疫细胞培养中的用途具有以下优点:
[0019]在免疫细胞培养过程中加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞，利用滋养细胞表面的免疫细胞生长因子和共刺激信号，不断刺激免疫细胞，而达到促使免疫细胞扩增的作用。由于直接加入滋养细胞，而免疫细胞生长因子和共刺激信号附着在滋养细胞膜表面，而非单独加入免疫细胞生长因子和细胞共刺激分子信号蛋白，因此，既延长细胞生长因子和共刺激信号的作用时间，也避免了单独加入细胞生长因子时发生的内吞过程，又降低免疫细胞生产成本，而且培养的免疫细胞还具有增值效果好、抗原专一性的T细胞比例尚、专一性尚、杀伤肿瘤细胞的功能强等优点，为免疫细胞治疗癌症的推广和效果的提尚起到推动作用。
【附图说明】
[0020]图1为本发明提供的滋养细胞表面共刺激分子4-1BBL的表达图；
[0021]图2为本发明提供的滋养细胞表面细胞生长因子IL-21的表达图；
[0022]图3为对照组细胞和试验组细胞所进行的细胞增殖倍数测试对照结果图；
[0023]图4为对照组细胞和试验组细胞所进行的细胞毒性测试对照结果图；
[0024]图5为对照组细胞和试验组细胞所进行的CTL细胞比例测试对照结果图。
【具体实施方式】
[0025]为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026]本发明提供一种免疫细胞培养方法，包括以下步骤:将外周血单个核细胞重悬于培养基中进行培养，当将细胞培养至需要CTL细胞扩增的阶段时，向细胞培养液中加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞，静置培养，得到最终的免疫细胞。
[0027]需要强调的是，对于本发明提供的免疫细胞培养方法，与传统技术相比，主要创新为:在细胞培养的过程中，加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞，由于细胞生长因子和共刺激分子附着在滋养细胞表面，因此，可延长细胞生长因子和共刺激信号的作用时间，还能够避免单独加入细胞生长因子时发生的内吞过程，所以，与传统方案相比，所使用的滋养细胞的量较小，从而降低免疫细胞生产成本。另外，还具有培养的免疫细胞增值效果好、抗原专一性的T细胞比例高、专一性高、杀伤肿瘤细胞的功能强等优点
[0028]在上述细胞培养的过程中，本发明人经过大量实验证明，只要加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞，既可实现上述的各种优点。而对于所加入的滋养细胞种类，只要满足表达细胞生长因子和共刺激分子这一个要求即可，对于滋养细胞在细胞培养过程中的加入时间点、滋养细胞的加入量、滋养细胞的加入种类以及滋养细胞加入后的细胞培养条件等，均可根据实际实验过程灵活调整，本发明均不限制。
[0029]基于上述思想，下面介绍几个细胞培养过程的实施例，需要强调的是，以下实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明。
[0030]细胞培养过程实施例一
[0031]步骤I，将外周血单个核细胞重悬于培养基中，在培养基中加入DC细胞活化因子IL-4，以及0.lug/ml/each的长链多肽，置于37°C、5%CO2孵箱中培养12小时，使抗原被单核细胞摄取、分解并递呈至单核细胞表面，得到一次培养液；
[0032]步骤2，向一次培养液中加入DC细胞类铎受体，激活因子IFN-γ以及0.lug/ml的黑色素肿瘤抗原短肽，置于37°C、5%C02孵箱中培养7天，激活单核细胞为成熟DC细胞，得到二次培养液；
[0033]步骤3，向二次培养液中加入K562滋养细胞，其中，滋养细胞加入量与加入时刻所述细胞培养液中CTL细胞的数量比为1:8，置于37°C、5 % CO2孵箱中培养12天，得到