一种转葡糖苷酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种转葡糖巧酶的制备方法，具体设及一种高转巧能力的转葡糖巧酶 的制备方法，属于酶制剂领域和食品添加剂领域。
【背景技术】
[0002] 转葡糖巧酶化lucosyltransferase，EC2.4.1.24)，也称α-转移葡萄糖巧酶、α-葡 萄糖转巧酶、某些场合也称作a-D-葡萄糖巧酶(a-D-glucosidase，EC 3.2.1.20)、α-葡萄糖 巧酶、麦芽糖酶。转葡糖巧酶可W切开麦芽糖和低聚麦芽糖等糖分子结构中α-1，4糖巧键， 并将游离出来a-D-葡萄糖残基转移到另一个a-D-葡萄糖分子或麦芽糖分子中的α-1，6位 上，是生产低聚异麦芽糖的关键酶制剂。
[0003] 低聚异麦芽糖（ΙΜ0)是一种功能性低聚糖，具水溶性膳食纤维功能、低热量、预防 離齿等特性，现已成为大多数健康食品的必需成分，随着低聚糖需求量日益增加，同时转葡 糖巧酶的用量也大幅度增加，对转葡糖巧酶的产量和质量等提出了更高的要求。
[0004] 目前国内市场的转葡糖巧酶产品存在的两方面的不足： 第一，生产过程中使用的转葡糖巧酶制剂在国内生产领域几乎处于空白，主要依赖进 口，价格昂贵、来源不稳定;第二，工业所用的转葡糖巧酶在低聚异麦芽糖生产中，转化率较 低，一般在30%-50%，如日本天野制药-株式会社属首家生产转葡糖巧酶制剂，生产工艺及其 成熟，但其转葡糖巧酶制剂对低聚异麦芽糖转化率也只有50%，工业上生产低聚异麦芽糖 时，必须提取、纯化、加工转化产物产品，才能得到高纯度的低聚异麦芽糖。因此，国内低聚 异麦芽糖产品只有50%纯度的ΙΜ0-500和90%纯度的ΙΜ0-900两种型号。
[000引转葡糖巧酶催化生成低聚异麦芽糖的效率称为转巧率，企业用转葡糖巧酶的转巧 率一般为30%-50%，因此高转巧率的转葡糖巧酶有利于降低生产成本，提高低聚麦芽糖的产 量。因此急需开发一种可生产高纯度低聚异麦芽糖的转葡糖巧酶。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种高转巧率的转葡糖巧酶的制备方法，使用该方法可制得 转巧率高达65%的转葡糖巧酶粗液，W解决低聚异麦芽糖生产中转巧率低的问题。
[0007] 为了实现上述目的，本发明的技术方案为:一种转葡糖巧酶的制备方法， W黑曲霉菌株（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，CGMCC No. 3.6478) 为出发菌株，采用液体发酵培养方式，经过大量发酵基配方优化实验，得到转巧率高的转葡 糖巧酶制剂，具体操作步骤如下： (1) 斜面培养 在装有察氏固体培养基的试管中接入黑曲霉菌株，30°C静置培养7天，制得成熟抱子， 加无菌水制得斜面抱子悬浮液； (2) 摇瓶扩大培养 在装有PDY培养基的摇瓶中接入斜面抱子悬浮液，在32°C、150r/min条件下培养，得摇 瓶抱子悬浮液； (3) 液体深层发酵 按10%质量百分浓度摇瓶抱子悬浮液的量接种于经高压灭菌后的优化液体发酵培养基 进行培养;其中：所述的优化发酵培养基配方由下述重量百分含量组成:薦糖5-12%，蛋白腺 2-8%，酵母提取物0.1-0.5%，K2HP04 0.1-1%，NaCl 0.1-1%，MgS〇4 0.01-0.05%，并特别添 加诱导物N-甲基-D-葡萄糖胺0.01-0.05%，然后溶于纯水，经混合均匀制得;所述摇瓶发酵 溫度在28-32°C，180r/min;优选的配方为：薦糖7%，蛋白腺5%，酵母提取物0.3%，K2册〇4 0.5%，NaCl 0.5%，MgS〇4 0.02%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，余量纯水； (4) 发酵液经高速离屯、，取上清液即得转葡糖巧酶粗酶液。
[0008] 利用本发明制得的转葡糖巧酶有如下特征： 1、 pH稳定性:该酶在溫度55°C，pH范围4.5-7.0时可稳定30min，最适P册.5; 2、 热稳定性:该酶在pH值6.0条件下，分别W不同溫度处理30min所得结果:55°C时该酶 仍保留其初始活性的90%，而在70°C时则为70%。
[0009] 本发明的有益效果:本发明特别添加诱导物N-甲基-D-葡萄糖胺，可刺激黑曲霉大 量分泌转葡糖巧酶。该酶可应用于低聚异麦芽糖生产的关键步骤-转化阶段，明显提高了反 应速率，低聚异麦芽糖转化率约为65%，远高于一般转葡糖巧酶的50%转化率，缩短了反应时 间，也为后续的提纯工序节约了成本，减少生产时间，降低了企业生产成本，解决了低聚异 麦芽糖生产中转化率低的问题。
【附图说明】
[0010] 图1为本发明制备方法流程图。
[0011] 图2为低聚异麦芽糖生产工艺流程示意图。
【具体实施方式】 [001引实施例1 如图1所示，一种转葡糖巧酶的制备方法，按
【发明内容】
所述的生产步骤，黑曲霉经斜面 培养7天后，制得成熟抱子，加无菌水制得斜面抱子悬浮液，接入装有PDY培养基摇瓶中，在 32°C，150r/min条件下培养4她，按10%的比例在装有100ML液体培养基的500ML摇瓶中接入 摇瓶抱子悬浮液。其中优化液体发酵培养基组分的重量百分含量如下:薦糖10%，蛋白腺2%， 酵母提取物0.3%，K2HP04 0.5%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，NaCl 0.15%，MgS04 0.02%，其余为 水，经混合均匀制得，初始抑6.05，分别在28°C、29°C、30°C、31°C、32°C，180r/min条件下培 养60h，取发酵液离屯、5000r/min，2分钟，取上清液检测酶活力，如表1。酶活检测方法(依据 地2525-2001《食品添加剂α-葡萄糖转巧酶》）（下同）进行测定。
[0013] 表1不同溫度下发酵培养对酶活的影响_^^_
' 从表1可W看出，溫度在28-32°C培养对酶活无明显差别，培养的溫度可W控制在28-321 °C 实施例2 如图1所示，一种转葡糖巧酶的制备方法，按
【发明内容】
所述的生产步骤，黑曲霉经斜面 培养7天后，制得成熟抱子，加无菌水制得斜面抱子悬浮液，接入装有PDY培养基摇瓶中，在 32°C，150r/min条件下培养4她，按10%的比例在装有100ML液体培养基的500ML摇瓶中接入 摇瓶抱子悬浮液。其中优化液体发酵培养基组分的重量百分含量如下:薦糖12%，蛋白腺2%， 酵母提取物〇.1%瓜册〇4 0.1%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，化C1 0.5%，MgS〇4 0.02%，其余为 水，经混合均匀制得，初始抑6.02，在32°C，180r/min条件下培养60h。取发酵液离屯、5000r/ min,2分钟，取上清液检测酶活力，同时采用不同诱导物N