从海人树干燥叶片中提取高质量基因组dna的方法及试剂盒的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物
技术领域：
，设及植物基因组DNA分离提取技术，尤其设及一种海人树干燥叶片基因组DNA的提取方法。【
背景技术：
】[0002]细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为基因组DNA。植物曲NA的提取主要用于基因文库构建、PCR分析及Southern杂交等，曲NA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前，已经发展了多种方法，可成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、初皮部等组织器官中提取出曲NA。[0003]但是有些情况下，不同植物甚至是同一种植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同W及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取曲NA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理W，综合W往的提取经验，从干燥的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类新鲜组织。从干燥组织中分离出的DNA由于多酪被氧化成栋褐色，多糖、单宁等物质与DNA结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低、质量差、易降解，影响了DNA质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增W。针对运一现象，已有许多学者对植物特别是顽樹型木本植物的曲NA提取纯化进行了改良和发展，如K.化oiKlha巧等WW班豆作为材料，分别对新鲜叶片和干燥叶片进行了曲NA提取，并对干燥叶片的提取方法进行了改进，但效果都不是很明显。[0004]海人树为苦木科，海人树属的灌木或小乔木，通常分布于太平洋至印度洋热带地区的小孤岛或珊瑚岛上，在我国分布于台湾和广东的西沙群岛等地。目前对海人树的分子生物学研究较少，特别是对海人树干燥叶片的基因组DNA提取还未见报道，而采用常规的CTAB法提取基因组DNA时，最终获得的DNA质量普遍较差，影响后续试验的进行，严重时可能会导致最终分析结果失败。[0005]参考文献[0006][1JCsaiklUM，BastianΗ,Brettschneider民etal.ComparativeanalysisofdifferentDNAextractionprotocols.Afast,universalmaxi-preparationofhighqualitypi过打tDNAforgeneticev过lu过tio打过打dphylogeneticstudies[J].PI过打tMolecularBiologyReporter,1998,61:69-86.[0007][2]易庆平等，植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J].安徽农业科学，2007,35(25):7789-7791.[000引[3]ChoudharyK，MathurN，Choudhary0PandPillaiU.ProtocolforIsolationofgenomicDNAfromDryandFreshLeavesofVignaSpeciesSuitablefor民apidand民estrictiondigestion[J].AdvancesinBiological民esearch，2008,2(5-6):83-89.【
发明内容】[0009]为了克服现有技术的不足和缺点，针对海人树干燥叶片富含多酪、多糖的特点，提供了一种海人树干燥叶片基因组DNA的方法，利用该方法能够获得高质量的基因组DNA。[0010]本发明人为解决上述问题进行了深入的研究，结果发现:通过改良传统CTAB裂解液组分配比，并通过氯仿-异戊醇，W及化is饱和苯酪-氯仿-异戊醇两步法抽提，可W实现高质量的提取海人树干燥叶片基因组DNA，从而完成了本发明。[0011]目P，本发明提供的一种提取海人树干燥叶片高质量基因组DNA的方法，包括：[0012]1.-种海人树干燥组织高品质基因组DNA的提取方法，该方法包括下述步骤：[0013]步骤A:将样品在液氮下迅速冷冻并研磨成干粉；[0014]步骤B:将步骤A得到的干粉加入预热的裂解液中混匀，使样品悬浮，水浴裂解30~60分钟，取出混合液冷却至室溫；[001引其中，所述裂解液的组分包含3%(g/v)的CTAB，100mM的Tris-HC1，2M的化Cl，25mM的邸ΤΑ，5%(g/v)的PVP，W及4体积％的护琉基乙醇；[0016]步骤C:将步骤B得到的混合液经氯仿-异戊醇抽提离屯、获得上清液后，再经化is饱和苯酪-氯仿-异戊醇抽提离屯、获得上清液；[0017]步骤D:将步骤C得到的上清液经沉淀剂沉淀并离屯、，再经洗涂液洗涂并离屯、后获得纯化的核酸；[0018]步骤E:将步骤D得到的纯化的核酸经干燥后，加入RNase消化RNA，获得消化RNA后的核酸溶液；[0019]步骤F:将步骤E获得的消化RNA后的核酸中加入无水乙醇沉淀基因组DNA，离屯、后弃上清液干燥后，加入溶解试剂，得到基因组DNA。[0020]2.根据项1所述的提取方法，步骤A使用的样品量为100~200mg。[0021]3.根据项1所述的提取方法，步骤B中裂解液的预热溫度为65~75°C，水浴裂解的溫度为65~75°C。[0022]4.根据项1所述的提取方法，其特征在于，步骤C中氯仿-异戊醇的体积比为24:1;Tris饱和苯酪-氯仿-异戊醇的体积比为25:24:1。[0023]5.根据项1所述的提取方法，其特征在于，步骤D中洗涂液为70~80%的乙醇，W及2~5M的NaCl。[0024]6.-种用于海人树干燥叶片基因组DNA的提取试剂盒，其包括CTAB裂解液、抽提试剂、W及核酸沉淀剂、洗涂剂和溶解剂；[0025]所述CTAB裂解液的组分包括3%(g/v)CTAB，100mMTris-HC1，2M化Cl，25mM邸ΤΑ，5%(g/v)PVP，W及4体积％β-琉基乙醇；[00%]所述抽提试剂包括体积比为24:1的氯仿-异戊醇，W及体积比为25:24:1的化is饱和苯酪-氯仿-异戊醇。[0027]7.-种用于海人树干燥叶片DNA提取的改良CTAB裂解液，其特征在于，组分包含3%(g/v)CTAB，100mMTris-肥1，2MNaCl，25mMEDTA，5%(g/v)PVP，W及4体积％β-琉基乙醇。[0028]发明效果[0029]根据本发明，在传统CTAB裂解液中加入PVP，W及采用氯仿-异戊醇，W及化is饱和苯酪-氯仿-异戊醇两步法抽提DNA，能够从海人树干燥叶片中提取高质量的基因组DNA。【附图说明】[0030]图1是本发明的实施例2的琼脂糖凝胶电泳图，[0031]其中，Ml为分子量标准，3为样品；[0032]图2是本发明的对比例1的琼脂糖凝胶电泳图，[0033]其中，Μ为分子量标准，3为样品。[0034]发明的【具体实施方式】[0035]本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突W本说明书中的定义为准。[0036]在一个方面，本发明提供了一种从海人树干燥叶片中提取高质量基因组DNA的方法，该方法包括：[0037]步骤Α:将样品在液氮下迅速冷冻并研磨成干粉；[0038]步骤Β:将步骤A得到的干粉加入预热的裂解液中混匀，使样品悬浮，水浴裂解30~60分钟，取出混合液冷却至室溫；[0039]其中，所述裂解液的组分包含3%(g/v)的CTAB，lOOmM的Tris-HCl，2M的化C1，25mM的邸ΤΑ，5%(g/v)的PVP，W及4体积％的护琉基乙醇；[0040]步骤C:将步骤B得到的混合液经氯仿-异戊醇抽提离屯、获得上清液后，再经化is饱和苯酪-氯仿-异戊醇抽提离屯、获得上清液；[0041]步骤D:将步骤C得到的上清液经异丙醇沉淀并离屯、，再经洗涂液洗涂并离屯、后获得纯化的核酸；[0042]步骤E:将步骤D得到的纯化的核酸经干燥后，加入RNase消化RNA，获得消化RNA后的核酸溶液；[0043]步骤F:将步骤E获得的消化RNA后的核酸中加入无水乙醇沉淀基因组DNA，离屯、后弃上清液干燥后，加入溶解试剂，得到基因组DNA。[0044]在本发明中，所述步骤A样品量为100~200mg。[0045]本发明人对传统的CTAB法进行了如下改进：[0046](1)对于传统CTAB法提取DNA的方法中，CTAB裂解液不能抑制样品中次生代谢产物被氧化。在原有CTAB裂解液中，加入聚乙締化咯烧酬(PVP)可W抑制样品中次生代谢产物被氧化的现象。[0047](2)对于传统CTAB法中，仅使用氯仿-异戊醇进行一步抽提的方法会造成DNA抽提效率低，且抽提过程中存在次生代谢产物易被氧化的现象，采用两步法抽提DNA，即首先用氯仿-异戊醇进行抽提，其次用化is饱和苯酪-氯仿-异戊醇进行二次抽提，W此保证DNA的抽提效率;同时二次抽提中的化is饱和苯酪，可减少抽提过程中次生代谢产物的氧化，最终获得高质量的DNA。[0048]在本说明书中，高质量是指基因组DNA的纯度和浓度高。纯度高即0D260/280介于1.6~1.8之间，0D260/230大于2.0。例如核酸的最大吸收波长为26化m，蛋白质的最大吸收波长为280nm，可W通过测定在260和280的0D比值来评价核酸的纯度。浓度高即每单位体积液体中所含的基因组DNA含量高，例如，在1OOmg的样品起始量下，提取得到的基因组DNA的浓度不低于30ng/yL，基因组DNA的总量不低于化邑。[0049]所述步骤B中使用的CTAB裂解液为3%(g/v)的CTAB，lOOmM的Tris-肥1，2M的NaCl，25mM的抓ΤΑ，5%(g/v)的PVP，W及4体积％的护琉基乙醇。该裂解液中的PVP浓度对本发明的方法至关重要。[0050]步骤B的裂解液的预热溫度为60~75°C，优选为70°C。反应溫度为60~75°C，优选为70°C。[0051]所述步骤C的氯仿-异戊醇的体积比为24:l，Tris饱和苯酪-氯仿-异戊醇的体积比为25:24:1。[0化2]步骤C中采用10000~13000巧m离屯、15分钟，优选采用12000巧m离屯、15分钟。[0053]所述步骤D使用的洗涂液可采用本领域技术人员所知的任何纯化DNA的试剂，如70%乙醇当前第1页1 2