一种高质量果实基因组dna的提取方法及提取试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种高质量果实基因组DNA的提取方法，特别是一种高质量葡萄果实 基因组DNA的提取方法及提取试剂盒，属于基因组学领域，可用于基因检测领域。
【背景技术】
[0002] DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，提取高纯度及结构完整的DNA是构建基 因文库和遗传图库等分子生物学研究的前提。
[0003] 传统的DNA提取与纯化，如CTAB法、SDS法是在裂解细胞的基础上，多次Tris饱和苯 酪、氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的 目的；加入RNA酶除去核酸中的RNA;然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉 淀，除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子，W免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促 反应，最后用TE溶解DNA备用。
[0004] 但是有些情况下，由于组织材料的外在性质不同W及化学成分、组织结构等内在 特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理。葡萄果实的基 因组DNA提取过程中，就因其富含多糖、多酪、单宁、色素及其它次生代谢物质，从而导致提 取出的DNA由于多酪被氧化成栋褐色，多糖、单宁等物质与DNA会结合成粘稠的胶状物，获得 的DNA常出现产量低、纯度差、易降解，影响了 DNA质量，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚 至不能作为模板进行PCR扩增。
【发明内容】
[0005] 由于葡萄果实材料的特殊性，为了克服现有技术的不足，得到便于构建基因文库 或遗传图库等分子生物学研究利用的高质量的基因组DNA，本发明提供了一种果实的高质 量的基因组DNA的提取方法。本发明W葡萄果实作为提取材料，采用优化改进的CTAB法进行 提取，获得了高质量的葡萄果实的基因组DNA。
[0006] 本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现:通过优化抽提步骤，并调整 裂解试剂和提取试剂的组分和各组分的配比，能够实现适用于果实样本、尤其是葡萄果实 的高质量的基因组DNA的提取方法，从而完成了本发明。
[0007] 即本发明包括：
[000引1. 一种葡萄果实的基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤A:将样本置于液氮中进行研磨，得到研磨样本；
[0010] 步骤B:将所述研磨样本置于裂解液中进行裂解，得到裂解产物；
[0011] 步骤C:将所述裂解产物置于第一提取液中进行抽提，得到第一抽提产物；
[001。步骤D:将所述第一抽提产物进行RNA酶消化，得到RNA酶消化产物；
[0013] 步骤E:将所述RNA酶消化产物进行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化产物；
[0014] 步骤F:将所述蛋白酶K消化产物置于第二提取液中进行抽提，得到第二抽提产物；
[0015] 步骤G:将所述第二抽提产物中置于异丙醇中进行沉淀，
[0016] 其中，
[0017] 所述第一提取液由氯仿和异戊醇组成，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1;
[0018] 所述第二提取液由Tris饱和苯酪、氯仿和异戊醇组成，所述Tris饱和苯酪、氯仿和 异戊醇的体积比为25:24:1。
[0019] 2.根据项1所述的提取方法，其特征在于，所述裂解液的组分为:2%(g/v，即质量/ 体积）的CTAB、抑为8的1 OOmM的Tri S-肥1缓冲液、1.4M的化C1溶液、20mM的抓TA、4 % (g/v，即 质量/体积）的PVP、0.5体积％的护琉基乙醇。
[0020] 3.根据项1或2任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤G后还包括步骤G-1: 将目标基因组DNA进行纯化。
[0021] 4.根据项1~3任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤C、步骤F和/或步骤G 后还包括步骤H:将所述各步产物进行离屯、。
[0022] 5.根据项1~4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述葡萄果实为新鲜果实。
[0023] 6. -种果实的基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括样本裂解试剂，第一提 试剂，第二提取试剂，助沉试剂和纯化试剂，其中，所述样本裂解试剂包括CTAB、化i S-HC1溶 液、化C1、EDTA、PVP、β-琉基乙醇，所述第一提取试剂包括氯仿和异戊醇，所述第二提取试剂 包括Tris饱和苯酪、氯仿和异戊醇。
[0024] 7.-种项1-5任一项所述提取方法或项6所述提取试剂盒在提取葡萄果实基因组 DNA中的应用。
[0025] 8.根据项7所述的应用，其特征在于，所述葡萄果实为新鲜果实。
[00%] 9.-种用于二代测序的果实DNA文库构建方法，包括如下步骤：
[0027] 步骤a:采用权利要求1-5任一项所述提取方法提取得到葡萄果实的基因组DNA;
[0028] 步骤b:将所述葡萄果实的基因组DNA打断到希望进行测序的长度，得到希望进行 测序的DNA片段；
[0029] 步骤C:将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
[0030] 步骤d:将所述平末端DNA片段进行3 '端加 A，得到3 '端加 A的DNA片段；
[0031] 步骤e:将所述3 '端加 A的DNA片段加接头，得到加接头DNA片段;和
[0032] 步骤f:将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
[0033] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:通过实施本发明记载的葡萄果实的基因 组DNA的提取方法，能够得到高质量的果实基因组DNA，特别是葡萄果实的基因组DNA。在本 说明书中，本发明记载的高质量基因组DNA中的"高质量"是指基因组DNA的纯度和浓度高。 纯度高即0D260/280介于1.6~1.8之间，0D260/230介于2.0~3.2之间。例如核酸的最大吸 收波长为260nm，蛋白质的最大吸收波长为280nm，可W通过测定在260和280的0D比值来评 价核酸的纯度。浓度高即每单位体积液体中所含的基因组DNA含量高，例如，在1 OOmg的样本 起始量下，提取得到的基因组DNA的浓度不低于30ngAiL，基因组DNA的总量不低于化邑。
【附图说明】
[0034] 图1是本发明的实施例1的琼脂糖凝胶电泳图，
[0035] 其中Ml-分子量标准，1-编号1的样本，2-编号2的样本；
[0036] 图2是本发明的对比例1的琼脂糖凝胶电泳图，
[0037] 其中，Ml-分子量标准，3-编号3的样本，4-编号4的样本。
【具体实施方式】
[0038] 本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义， 如有冲突W本说明书中的定义为准。
[0039] 在一个方面，本发明提供了一种果实的基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
[0040] 步骤A:将样本置于液氮中进行研磨，得到研磨样本；
[0041 ]步骤B:将所述研磨样本置于裂解液中进行裂解，得到裂解产物；
[0042] 步骤C:将所述裂解产物置于第一提取液中进行抽提，得到第一抽提产物；
[0043] 步骤D:将所述第一抽提产物进行RNA酶消化，得到RNA酶消化产物；
[0044] 步骤E:将所述RNA酶消化产物进行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化产物；
[0045] 步骤F:将所述蛋白酶K消化产物置于第二提取液中进行抽提，得到第二抽提产物；
[0046] 步骤G:将所述第二抽提产物中置于异丙醇中进行沉淀。
[0047] 其中，
[0048] 所述第一提取液由氯仿和异戊醇组成，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1;
[0049] 所述第二提取液由Tris饱和苯酪、氯仿和异戊醇组成，所述Tris饱和苯酪、氯仿和 异戊醇的体积比为25:24:1。
[0050] 优选的，所述裂解液的组分为：2%(g/v，即质量/体积）的CTAB、pH为8的lOOmM的 Tris-HCl缓冲液、1.4M的化C1溶液、20mM的抓TA、4% (g/v，即质量/体积）的PVP、0.5体积％ 的β-琉基乙醇。
[0化1]所述裂解液的预热溫度为60~75°C，优选为65°C。反应溫度为60~75°C，优选为65 °C〇
[0052] 本发明提供的果实的基因组DNA的提取方法经过了本发明人的反复优化及验证， 从而解决了传统CTAB提取方法(例如对比例1所述的方法)应用于葡萄果实样本时、所得文 库质量不高的技术难题。
[0053] 优选的，所述步骤G后还包括步骤G-1:将目标基因组DNA进行纯化。本发明中，对于 纯化的方式没有特殊限制，可W采用本技术领域的常规方法来进行，例如可W采用70%乙 醇、75%乙醇、70%异丙醇，W及高盐溶液(化C1)等，优选为75%的乙醇和1.4M的化C1进行 纯化。
[0054] 优选的，所述步骤C、步骤F和/或步骤G后还包括步骤H:将所述各步产物进行离屯、。 本发明中，对于离屯、没有特殊限制，可W采用本技术领域的常规方法来进行，例如可W采用 10000~13000巧m离屯、，优选采用12000巧m离屯、。
[0055] 优选的，通过本发明的提取方法得到的基因组DNA可W采用本技术领域的常规方 法来进行保存，例如可W采用本领域技术人员所熟知的任何试剂溶解保存，如无菌双蒸水， TE溶液。
[0056] 优选的，所述葡萄果实为新鲜果实。
[0057] 在另一个方面，本发明还提供了一种果实的基因组DNA的提取试剂盒，其特征在 于，包括样本裂解试剂，第一提取试剂，第二提取试剂，助沉试剂和纯化试剂，其中，所述样 本裂解试剂包括CTAB、Tr i S-肥1溶液、化C1、邸TA、PVP、β-琉基乙醇，所述第一提取试剂包括 氯仿和异戊醇，所述第二提取试剂包括Tris饱和苯酪、氯仿和异戊醇。
[0058] 在另一个方面，本发明还提供了所述提取方法或所述提取试剂盒在提取葡萄果实 基因组DNA中的应用。
[0059] 优选的，所述葡萄果实为新鲜果实。
[0060] 在另一个方面，本发明还提供了一种用于二代测序的果实DNA文库构建方法，包括 如下步骤：
[0061] 步骤a:采用权利要求1-5任一项所述提取方法提取得到葡萄果实的基因组DNA;
[0062] 步骤b:将所述葡萄果实的基因组DNA打断到希望进行测序的长度，得到希望进行 测序的DNA片段；
[0063] 步骤C:将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末